D. Špoljarić, Tihana Fumić, D. Kezić, H. Valpotić, Vesna Fabijanić, Maja Popović, S. Sladoljev, G. Mršić i I. Valpotić
Daniel Špoljarić, dr. med. vet., znanstveni novak, Tihana Fumić, dr. med. vet., Dubravko Kezić, dr. med. vet., znanstveni novak, dr. sc. Hrvoje Valpotić, dr. med. vet., viši asistent, dr. sc. Maja Popović, dr. med. vet., redovita profesorica, dr. sc. Ivica Valpotić, dipl. ing. biol., redoviti profesor; Vesna Fabijanić, dipl. ing. biol., Srednja škola “Bartul Kašić”, Pag; dr. sc. Srećko Sladoljev, dipl. ing. biol., Imunološki zavod, Zagreb; Gordan Mršić, dipl. ing. biotehnologije, Sveučilišni studijski centar za forenzične znanosti, Split
UvodIzvori i vrste ß-glukanaGrađa i funkcija ß-glukanaMehanizam unosa i učinci β-glukana na crijevni imunosni sustav svinjeUčinci β–glukana na sustavnu imunost svinjePotencijali i ograničenjaZaključne pripomeneSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
S porastom znanja o imunosnom sustavu i njegovoj endogenoj modulaciji monokinima i limfokinima, postalo je jasno da je egzogena imunomodulacija važan profilaktički i terapijski pristup u preventivi i liječenju različitih bolesti životinja s pomoću široke lepeze imunomodulacijskih tvari u novije vrijeme nazvanih modifikatorima imunosnog odgovora (MIO). Od 1980.-tih pojavljuju se zanimljiva izvješća o brojnim prirodnim ili sintetičkim tvarima koje mogu uspostaviti oštećenu imunosnu funkciju ili pak pojačati nespecifičnu i specifičnu imunost u domaćih životinja pa stoga djeluju kao imunomodulatori (Blecha i Charley, 1990., Valpotić, 2000.). Danas su oni važna sastavnica alternativne strategije nekliničkoj uporabi antibiotika, napose u proizvodnji životinja namijenjenih ljudskoj prehrani i to posebice kao alternativna profilaksa/terapija za rastući broj mikroba rezistentnih na antibiotike (Gallois i sur., 2009.). Zajedničkim djelovanjem temeljnih i kliničkih veterinarskih imunologa, uzgajivača stoke i proizvođača krmnih smjesa, imunomodulacija bi mogla unijeti u veterinarsku medicinu novi kurativni zamah sličan onom koji su svojevremeno učinili antibiotici u borbi protiv infekcijskih bolesti. Skupina temeljito istraživanih MIO su β–glukani, prirodni polisaharidi, opisani u znanstvenoj zajednici kao moćni imunostimulatori (Bohn i BeMiller, 1995. Williams, 1997., Tzianabos, 2000., Brown i Gordon, 2003.) i vrlo djelotvorni antagonisti benignih i malignih tumora (Akramiene i sur., 2007.). Desetljećima poznati kao sastavnice stanične stijenke nekih patogenih bakterija, pekarskog kvasca, brojnih vrsta gljiva, morskih steljnjača (kao što su smeđe i dijatomejske alge), te biljaka, posebice trava, uglavnom su istraživani na laboratorijskim glodavcima (Vetvicka i sur., 2007., Shen i sur., 2007.) radi utvrđivanje njihovih potencijala za uporabu u humanoj medicini (Vetvicka i sur., 2002., Chen i Seviour, 2007.), ali i na brojnim vrstama beskralješnjaka i kralješnjaka (Vetvicka i Yvin, 2004.), uključujući i čovjeka (Soltanian i sur., 2009.). U tradicijskoj medicini u Japanu još od 1980. godine rabe se β–glukani izdvojeni iz dviju vrsta gljiva (šitake i maitake) za liječenje tumora. Premda su glukani ponešto istraživani i na beskralješnjacima, ribama te domaćim sisavcima, za sada je njihov imunostimulacijski i protutumorski potencijal nedovoljno poznat i prepoznat u veterini. U novije vrijeme pojavljuju se izvješća o učincima β–glukana izdvojenog iz pekarskog kvasca Saccharomyces cerevisiae ili biljne vrste Astragalus membranaceus podrijetlom iz Kine, na rast, digestiju i imunosne pokazatelje u odbijene prasadi (Mao i sur., 2005., Li i sur., 2006., Price i sur., 2010.). Pripravci β–glukana iz pekarskog kvasca S. cerevisiae i gljive Sclerotium rolfsii pokazali su sposobnost u zaštiti odbijene prasadi od pokusne infekcije F4+ enterotoksigenim sojem bakterije Escherichia coli (ETEC) (Stuyven i sur., 2009.). Međutim, i β–glukani iz ječma i zobi te iz smeđe morske alge Laminaria spp. povoljno su djelovali na neke proizvodne i imunosne pokazatelje tovljenika (O’Shea i sur., 2010.) i sisajuće prasadi (Leonard i sur., 2010.).
S obzirom da su potonja istraživanja komplementarna našem pristupu poticanja nespecifične imunosti odbijene prasadi s pomoću MIO (gdje smo posebice istraživali one podrijetlom iz bakterija, a u novije vrijeme i jedan pripravak iz pekarskog kvasca) i nutraceutika radi pojačavanja otpornosti na enteričke infekcije bakterijske etiologije, to smo obratili pozornost na prirodne tvari s alternativnim potencijalima antibiotika u hrani. Od tih su tvari, napose iz pekarskog kvasca, osim β-D-glukana, pažnju istraživača privukli i ugljikohidratni dijelovi manoproteina ili α-manani, koji moduliraju imunosni odgovor svinja specifičnim interakcijama s njihovim imunkompetentnim stanicama (Kogan i Kocher, 2007.). Tako je utvrđeno da mananoligosaharid (MOS) umješan u hranu za odbijenu prasad potiče porast brojnosti CD45+, CD4+, CD8+ i CD21+ limfocita periferne krvi (LPK) i CD45RA+ djevičanskih limfoidnih stanica u sluznici ileuma te povećava sposobnost fagocitoze granulocita periferne krvi (Valpotić, 2009.). Poznato je da se manani vežu za manozu prisutnu na membrani limfoidnih i mijeloidnih stanica i tako mijenjaju njihovu imunosnu aktivnost (Tzianabos, 2000.), dok se za β-D-glukane smatra da djeluju imunomodulacijski nakon vezanja za receptore na površini makrofaga i polimorfonuklearnih leukocita (Brown i Gordon, 2003.).Manani i glukani već su predlagani kao MIO, pogodni za profilaksu i terapiju infekcija u čovjeka (Masihi, 2000.) i farmskih životinja, uključujući i svinju (Fortin i sur., 2003., Kogan i Kocher, 2007., Gallois i Oswald, 2008.), a napose mladu prasad (Van Nevel i sur., 2003.). Međutim, s obzirom na brojnost MIO i česti nedostatak standardizacije pripravaka iz različitih izvora, kao i na kontroverzna izvješća o njihovoj djelotvornosti, teško je odabrati potpuno provjerene MIO koji djeluju kao nespecifični pojačivači imunosnog odgovora ili sinergistički kao adjuvansi s cjepivima.
Stoga ćemo u ovom preglednom radu poredbeno analizirati imunomodulacijske osobitosti pripravaka β–glukana, iz nekoliko izvora i u različitim koncentracijama, istraživanih na modelu domaće svinje (pritom ističući njihove potencijale, ali i ograničenja), u odnosu na imunostimulacijske učinke nekih također egzogenih MIO, podrijetlom iz bakterija i pekarskog kvasca (primjerice MOS), testiranih u nas u in vitro i in vivo uvjetima na sisajućoj i odbijenoj prasadi.
Izvori i vrste ß-glukana
Brojnost pojedinih glukana gotovo je jednaka mnoštvenosti izvora iz kojih su izdvojeni. Kao prirodni polisaharidi, β–glukani, su desetljećima poznati u znanosti kao sastojci brojnih biljnih vrsta, posebice iz porodice trava (Gramineae).
Posije vrsta kao što su ječam, zob, raž i pšenica sadrže od 1% do 7% β–glukana.
U kineskoj tradicijskoj medicini poznate su biljne vrste Astragalus membranaceus (Leguminosae) i Cnidium officinale (Umbelliferae) iz drugih porodica, kao što su štitarke i mahunarke, iz kojih su izdvojeni β–glukani. Međutim, sadrže ih i brojne vrste morskih algi. Tako su glukani izdvojeni iz vrsta smeđih algi – laminarija (Laminaria digitata i L. hyperborea), nazvani fikarin, laminarin i fukoidan, a pričuvni glukani koje proizvode vrste dijatomejskih algi (Skeletonema costatum, Chaetoceros mülleri, C. debilis, Thalassiosira weissfloggi, T. pseudonana) nazvani su krizolaminarani. Ovdje treba istaknuti da su morski ekosustavi, napose morske alge, najbogatiji izvor glukana, jer su još uglavnom nedirnuti ili samo neznatno korišteni. Među morskim algama su i brojni arhetipovi prilagođenih na život u ekstremnim uvjetima. Njihova molekularna građa i biokemijski procesi prilagođeni su na hladnoću, a s obzirom da su trajno izloženi izuzetno varijabilnim mikrobnim uvjetima, razvili su snažne protumikrobne sustave, uključujući i β–glukane (Vetvicka i Yvin, 2004., Vetvicka i sur., 2007.).
Nadalje, različiti oblici glukana izdvojeni su iz pivskog i pekarskog kvasca te brojnih vrsta gljiva. Primjerice stanična stijenka pekarskog kvasca sastoji se od tri sloja: unutarnjeg građenog od netopivog β–glukana (30-35%), srednjeg od topivog β–glukana (20-22%) i vanjskog od glikoproteina (30%) (Tokunaka i sur., 2000.). U istraživanjima najčešće rabljeni β–glukani iz pekarskog kvasca S. cerevisiae su glukan fosfat, male molekularne mase, PGG-glukan i zimosan, velike molekularne mase (Brown i Gordon, 2003.). Miceliji vrsta gljiva šitake (Lentinus edodes), maitake (Grifola frondosa), šizofilan (Shizophyllum commune), bijele truleži (Sclerotinia sclerotiorum) i njezinih srodnika (S. glucanicum i S. rolfsii), potom plemenite pečurke ili šampinjona (Agaricus bisporus) i njezinih srodnika (A. blazei, A. sylvaticus), kovrčaste kokice (Sparassis crispa), bukovače (Pleurotus ostreatus), i mešimakobu gljive (Phellinus linteus), sadrže β–glukane nazvane prema njihovim izvorima: lentinan, grifolan, šizofilan, SSG-glukan, skleroglukan ili manan (Wasser, 2002., Barbisan i sur., 2002., Kim i sur., 2003., Brown i Gordon, 2003., Shen i sur., 2007.).
Izvor: H. Yamaguchi, Medicinski fakultet Sveučilišta u Tokiju, Japan
Sastavnice stanične stijenke nekih patogenih vrsta gljivica, kao što su Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum i Candida albicans također su β–glukani (Akramiene i sur., 2007.). β–glukani, napose kurdlan, izdvojeni su i iz stanične stijenke bakterije Alcaligenes faecalis var. myxogenes, kao i iz brojnih drugih bakterijskih vrsta i njihovih mutanata, primjerice iz Agrobacterium sp. ATCC 31749 (McIntosh i sur., 2005.).
Međutim, glukani nisu nađeni u životinja pa se smatra da su ti ugljikohidrati klasični molekularni biljezi patogenih vrsta mikroba (bakterija, gljivica), prepoznatljivi kao strane molekule-imunogeni urođenom imunosnom sustavu kralješnjaka i beskralješnjaka. Dok se kod ovih potonjih to prepoznavanje odvija posredstvom stanica i molekula u tjelesnim tekućinama, dotle se to u kralješnjaka odvija isključivo posredstvom staničnih receptora (Brown i Gordon, 2003.).
Građa i funkcija ß-glukana
Glukani su heterogena skupina linearnih, dugolančanih, nerazgranatih polisaharida nastalih polimerizacijom monomera D-glukoze glikozidnim vezama. Molekula glukana sastoji se od glavnog lanca građenog od β (1, 3) – povezanih β-D-glukopiranoznih jedinica sa β (1,4 i/ili 1,6) – povezanim bočnim lancima različitog rasporeda i dužine. β-glukani formiraju „crvolike” cilindrične makromolekule od oko 250.000 glukoznih monomera koji mogu stvarati poprečne veze u prostoru u kojem se nalaze celotriozne jedinice. Tako stvaraju termoreverzibilne beskonačne mreže gelova. Preko 90% β-(1→ 4) veza su između celotriozil i celotetraozil jedinica koje su pak povezane pojedinačnim β-(1→3) vezama.
U glukane ubrajamo: celulozu (β-1,4-glukan), laminarin (β-1,3- i β-1,6-glukan), kurdlan (β-1,3-glukan), krizolaminaran (β-1,3-glukan), fikarin (β-1,3-glukan), pululan (α-1,4- i α-1,6-glukan), škrob (α-1,4- i α-1,6-glukan), glikogen (α -1,4- i α-1,6-glukan), dekstran (α-1,6-glukan), lentinan i lihenin. Ove strukturne razlike makromolekula glukana mogu imati značajan utjecaj na njihovu biološku djelotvornost. Primjerice, razlike u dužini polisaharidnih lanaca, razmjer njihova grananja i dužina tih grana određuju različitost u iscrpcima koji se mogu izdvojiti iz različitih izvora, kao i različitost u molekularnim masama.
Njihovi mehanizmi djelotvornosti na organizam, temelje se na prepoznavanju njihovih struktura kao tuđih makromolekula pa je imunosni sustav domaćina stimuliran zbog njihove prisutnosti, a napose imunosne stanice monocitno-makrofagnog reda i druge stanice urođene imunosti.
Općenito, in vitro istraživanja su pokazala da β-glukani velike molekularne mase (kao što je zimosan) mogu izravno aktivirati leukocite na fagocitozu, citotoksičnost i mikrobicidnost, dok oni manje i vrlo male molekularne mase (kao što su glukan fosfat i laminarin) pokazuju biološku aktivnost in vivo, ali su njihovi učinci na stanice domaćina nejasni ili ih nema (Bohn i BeMiller, 1995., Brown i Gordon, 2003., Akramiene i sur., 2007.).
Glukani su otporni na enzimsku i kiselinsku razgradnju u ustima i netopivi su u vodi (zimosan). Uglavnom se rabe kao zamjena mastima, a prepoznati su i kao MIO, protuinfekcijska i protutumorska sredstva, ali i po drugim učincima na zdravlje (snižavanju kolesterola i triglicerida i normalizaciji razine šećera u krvi) i reparativne/regenerativne procese (Brown i Gordon, 2003., Fortes i sur., 2006., Akramiene i sur., 2007., Soltanian i sur., 2009.). S obzirom na poznatu činjenicu da su u intenzivnoj proizvodnji domaćih životinja namijenjenih ljudskoj prehrani (napose svinja), racionalniji i rentabilniji preventivni od terapijskih pristupa, to je u žarištu znanstvenog zanimanja učinkovitost β-glukana kao nutraceutika i MIO, koji se dodaje u hranu u kritičnim razdobljima (visoka suprasnost, porod, odbiće) u mnoštvenom ugoju svinja (Fortin i sur., 2003., Van Nevel i sur., 2003., Kogan i Kocher, 2007., Gallois i Oswald, 2008., Gallois i sur., 2009.).
Isti je oblik pripravka pogodan i za in vitro istraživanja stimulacijskih obrazaca imunosnih stanica (ponajprije mijeloidne loze) pa je u tu svrhu nedavno naručen β-1,3/1,6-glukan s 85% glukopolisaharida, visoke bakteriološke ispravnosti provjerene laboratorijskim pretragama. Očekujemo da će uskoro biti testirana njegova učinkovitost na makrofage/monocite i granulocite u in vitro uvjetima, dok će istvremeno u in vivo uvjetima biti provjerena imunomodulacijska sposobnost β-glukana iz plemenite pečurke A. bisporus na modelu odbijene prasadi.
Naime, naša iskustva s pripravkom α-manana ili MOS (Bio-Mos®; Alltech Inc.) (Valpotić, 2009.), kao i pregledni rad o njegovim učincima u proizvodnji svinja (Kogan i Kocher, 2007.), podupiru napore brojnih istraživačkih skupina koje intenzivno tragaju za alternativama protumikrobnim promotorima rasta (desetljećima rabljenima u intenzivnim uzgojima svinja), prirodnim bioaktivnim molekulama (napose glukanima i mananima) koji kao dodatci hrani mogu održavati zdravlje i unaprijediti proizvodnost svinja (Gallois i Oswald, 2008., Gallois i sur., 2009.).
Mehanizam unosa i učinci β-glukana na crijevni imunosni sustav svinje
Poznato je da se glukani vežu za receptore na staničnoj membrani makrofaga, (Slika 4) neutrofila, NK stanica, T stanica, dendritičkih stanica, fibroblasta i endotelnih stanica stijenke krvnih žila.
Do sada su otkrivena četiri takva receptora: CR3 (receptor za komplement), Dektin-1 (receptor za poticanje fagocitoze) te laktozilceramidni (LacCer; CDw17) i tzv. scavenger (od engl. čistač oštećenih/mrtvih stanica) receptori (Brown i Gordon, 2003., Herre i sur., 2004., Fortes i sur., 2006.).
Vezanje β–glukana za receptor Dektin-1 (βGR), u koordinaciji s receptorom TLR-2, potiče makrofage na fagocitozu i izlučivanje citokina (IL-1,IL-2, IL-6, IFNγ i TNFα), dok njegovo vezanje za receptor za komplement CR3 (CD11b/CD18) na NK stanicama, neutrofilima i CD8+ limfocitima izaziva pojačanu citotoksičnost tih stanica.
Ostala dva receptora, vežu β–glukan i posreduju u nizu signala koji pospješuju imunosnu reaktivnost, napose pojačavanje proizvodnje monocita i granulocita, porast titrova protutijela i prostaglandina E2, aktivacija komplementa i otpuštanje lizosomalnih enzima (Vetvicka i Yvin, 2004., Chen i Seviour, 2007., Akramiene i sur., 2007.).
Premda postoje vrlo indikativni podatci o učincima β–glukana na crijevni imunosni sustav miša (gdje se najranije mogu očekivati) (Shen i sur., 2007.), podatci o učincima glukana na crijevni imunosni odgovor svinje vrlo su rijetki (Gallois i sur., 2009.), a podataka za odbijenu prasad ili za sada nema ili nam nisu bili dostupni. Postoje podatci da dodatak viših koncentracija (2,5%) β–glukana u hranu za sisajuću prasad (u dobi od 14 dana) dovodi do porasta α- činitelja nekrotiziranja tumora (TNF-α) i mRNA IL-1β, ali također i do porasta mRNA IL1 – receptorskog antagonista (IL-1Ra) u sluznici ileuma, nakon što je prasad imunizirana bakterijskim lipopolisaharidom (LPS) (Eicher i sur., 2006.). Biološko značenje tih podataka teško je procijeniti budući da ti citokini sudjeluju u proupalnim (TNF-α i IL-1β) i protuupalnim (IL-1Ra) procesima.
Štoviše, u tovnih svinja dodavanje niske koncentacije (0,03%) β–glukana u hranu dva tjedna prije klanja nije utjecalo na razine IgM, IgA ili brojnost CD4+ i CD8+ T stanica u sluznici ileumu (Sauerwein i sur., 2007). U odbijene prasadi pokusno inficirane F4+ ETEC sojem dodavanje pripravaka β–glukana (0,05 do 0,075%) u hranu smanjuje brojnost IgM+ i IgA+ plazma stanice u Peyerovim pločama (PP) jejunuma/ileuma i slezeni, ali ne i u mezenterijskom limfnom čvoru (MLČ) u odnosu na kontrolnu prasad (Stuyven i sur., 2009.). U potonje je prasadi zabilježen, osim jakog porasta serumskih protutijela IgM razreda specifičnih za F4 antigen, i porast brojnosti IgM+ plazma stanica u slezeni što odražava snažan sustavni humoralni imunosni odgovor na infekciju ETEC sojem. Međutim, i razmjerno velika brojnost plazma stanica u testiranim limfatičkim tkivima probavnog sustava (LTPS) upućuje na njihovu jaku aktivaciju što je rezultiralo neutralizacijom uzročnika i posljedičnim padom brojnosti CFU u fecesu i izostankom dijareje. Sustavni i crijevni imunosni odgovori uobičajeno uzgajane prasadi, peroralno imunizirana F4 fimbrijskim antigenom bakterije E. coli i hranjene s dodatkom β–glukana tijekom 5 tjedana, bili su nešto jači u odnosu na one u gnotobiotičke prasadi. Naime, ta je prasad imala povećan broj IgA+ B stanica u PP i MLČ, pojačano ekspresiju mRNA za IL-1α u slezeni, ali i nepromijenjene razine ukupnih i specifičnih protutijela u serumu, kao i veličinu PP (Stuyven i sur., 2010.).
Premda nedostatni i nekonzistentni, ovi podatci upućuju na činjenicu da je za poticanje crijevne imunosti nužno utvrditi optimalnu dozu pripravka, što potvrđuju znatno brojniji i povoljniji podaci o učincima β–glukana na sustavnu imunost u svinje (Gallois i sur., 2009.).
Učinci β–glukana na sustavnu imunost svinje
Potencijali β–glukana u modulaciji sustavne imunost svinje, posebice urođene imunosti, pobudili su mnogo veće zanimanje, ali su izvješća o učincima pripravaka vrlo oprečna (Tablica 1).
Ovi obrasci izlučivanja proupalnih/protuupalnih citokina potvrđeni su u in vivo uvjetima u prasadi hranjene istim koncentacijama glukana, nakon intraperitonealnog davanja LPS radi izazivanja upalne reakcije (Li i sur., 2005., 2006.). Isti su autori zabilježili i porast proliferacije LPK te povećanu proizvodnju imunoglobulina (Ig) nakon imunizacije prasadi ovoalbuminom. U rano odbijene prasadi (s 18 dana), tijekom dva tjedna raste razina haptoglobina, a potom ostaje stabilna. Dodavanje 0,025% ili 0,05% β–glukana u hranu zaustavlja taj porast (Dritz i sur., 1995.). Međutim, u prasadi odbijene s 28 dana zabilježen je porast razine haptoglobina samo tijekom prvog tjedna po odbiću, što se teško može pripisati učinku β–glukana (0,015–0,03%) dodanog u hrani (Hiss i Sauerwein, 2003., Sauerwein i sur., 2007.). Isto su tako nekonzistentni podatci o učincima β–glukana (0,03%) na sposobnost neutrofila da proizvode reaktivne međuspojeve kisika, da vrše fagocitozu i citotoksičnost ovisnu o protutijelu (engl. ADCC=antibody-dependent cellular cytotoxicity) (Dritz i sur., 1995., Sauerwein i sur., 2007.).
Jednako tako, β–glukan nije utjecao ni na proizvodnju superoksidnih aniona i baktericidnost plućnih makrofaga, niti na ekspresiju CD14 membranskog biljega (Dritz i sur., 1995.). Dok je proliferacijska sposobnost LPK ostala nepromijenjena (Hiss i Sauerwein, 2003.), proizvodnja različitih razreda imunoglobulina (Ig) mijenjala se prema IgA i IgG odgovorima ovisno o porastu doze (0,3%) pripravka (Sauerwein i sur., 2007.). Međutim, ovakve promjene razina serumskih Ig nisu bile ponovljive, i vjerojatno se mogu povezati s različitim razdobljima (od 4, odnosno 8 tjedana po odbiću) izlaganja pripravku (Kim i sur., 2000., Hahn i sur., 2006.). Sustavna specifična imunizacija prasadi (hranjene s dodatkom 0,02-0,04% β–glukana) protiv atrofičnog rinitisa rezultirala je nedostatnom proizvodnjom protutijela (Hahn i sur., 2006.), dok je naprotiv imunizacija prasadi ovoalbuminom (hranjene s dodatkom 0,005% β–glukana) kratkotrajno potaknula povišeni titar specifičnih protutijela (Li i sur., 2005.).
Zanimljivo je da različiti pripravci β–glukana (u koncentraciji od 0,05% ili 0,015-0,03%) nisu djelovali sinergistički s cjepivom protiv PRRS virusa (Hiss i Sauerwein, 2003.) ili s fimbrijskim/toksinskim antigenima bakterije E. coli (Decuypere i sur., 1998.). Potonji su autori ipak utvrdili da hranjenje suprasnih krmača s dodatkom β–glukana izaziva porast titra protutijela specifičnih za F4 i F5 fimbrijske antigene u mlijeku, ali ne i u kolostrumu. Međutim, hranjenje odbijene prasadi s dodatkom β–glukana iz dva izvora (pekarski kvasac ili gljiva S. rolfsii) nije rezultiralo sličnim porastom razine serumskih protutijela za F4 antigen, već naprotiv izaziva pad razine tih protutijela nakon imunizacije F4+ ETEC sojem (Stuyven i sur., 2009.).
Noviji podatci o učinku β–glukana na pasivnu imunost neonatalne prasadi oprečni su ovim prethodnim izvješćima.
Naime, u visoko suprasnih krmača hranjenih s dodatkom laminarina iz dva izvora (β–glukana iz dviju vrsti morskih algi L. digitata i L. Hyperborea) utvrđen je porast razine IgG u kolostrumu, kao i porast razina IgG i IgA u serumu sisajuće prasadi. Zabilježen je i porast sposobnosti fagocitoze, ali ne i brojnosti leukocita te pad brojnosti LPK (Leonard i sur., 2010.). U odbijene prasadi, uporaba β–glukana iz istih vrsta algi izaziva porast brojnosti monocita i ekspresije mRNA za IL-8 (Reilly i sur., 2010.).
Kada tome dodamo podatke o porastu izlučenja IL-1β i in vitro reaktivnosti LPK na ConA, a također i IL-2 nakon imunizacije s bakterijskim LPS u odbijene prasadi hranjene s dodatkom β–glukana iz biljke Astragalus membranaceus (Mao i sur., 2005.), onda razabiremo njihovu nekonzistentnost i nepredvidivost. One se mogu tumačiti uporabom polisaharidnih/oligosaharidnih iscrpaka iz različitih vrsta biljaka, gljiva ili algi, u koncentracijama za koje nema konzistentnih dokaza o njihovoj djelotvornosti, kao i nedostatnim in vitro istraživanjima (prije in vivo pokusa) koja bi nedvojbeno definirala bioaktivne molekule u tim iscrpcima, i vjerojatno pojasnila mehanizme njihova djelovanja na imunosne stanice. Naime, u većini navedenih istraživanja spominje se dodavanje iscrpaka stanične stijenke pekarskog kvasca koji sadrže jedan od bioaktivnih polisaharida – glukan ili manan, ali je najčešće ispravnije ustvrditi da derivati kvasca sadrže obje ove makromolekule.
Potencijali i ograničenja
Premda se već od 1980.-tih pojavljuju brojna izvješća o različitim prirodnim ili sintetičkim tvarima koje mogu uspostaviti oštećenu imunosnu funkciju ili pak pojačati nespecifičnu i specifičnu imunost u domaćih životinja namijenjenih ljudskoj prehrani pa stoga djeluju kao imunomodulatori ili MIO (Blecha i Charley, 1990., Valpotić, 2000.), od 2006. godine (nakon donošenja propisa br. 1813/2003. o zabrani dodavanja subterapijskih doza antibiotika u hranu kao promotora rasta) intenzivno se istražuju tvari koje mogu modulirati imunosne funkcije farmskih životinja. Tako su u žarište zanimanja brojnih istraživačkih skupina došle različite bioaktivne tvari prirodnog podrijetla (iz mikroba, gljiva, algi, biljaka ili životinja) koje a priori ispunjavaju osobitosti MIO (Brown i Gordon, 2003., Vetvicka i Yvin, 2004., Akramiene i sur., 2007., Kogan i Kocher, 2007., Shen i sur., 2007., Gallois i Oswald, 2008., Gallois i sur., 2009.). Naše su zanimanje od kraja 1980.-tih privukli MIO mikrobnog podrijetla, napose iz nekih vrsta bakterija i pekarskog kvasca pa smo istraživali njihove in vitro i in vivo učinke na urođenu i stečenu imunost prasadi iz intenzivnog uzgoja (Tablica 2). S obzirom da je većina ovih istraživanja provedena u in vitro uvjetima, a pri tome su polučeni rezultati bili više nego indikativni (posebice za PGM/PGP), smatramo da su testirani pripravci (inače znatno više istraživani u svrhu terapije malignih tumora čovjeka, ali bez većih uspjeha) zavrijedili da se njihova učinkovitost provjeri i u in vivo pokusima. Za sada je to provedeno samo s pripravkom MOS, koji je kao dodatak hrani (0,2%) u odbijene prasadi izazvao porast udjela CD45+, CD4+, CD8+ i CD21+ LPK i brojnosti CD45+ limfoidnih stanica u IFP i PPI te pojačavanje fagocitozne sposobnosti granulocita periferne krvi (Valpotić, 2009.).
Isti je pripravak u kombinaciji s pokusnim dvovaljanim cjepivom protiv kolidiareje i kolienterotoksemije odbijene prasadi također potaknuo fagocitozu granulocita (Tablica 2). Slijedom navedenoga, smatramo da su rezultati dobiveni s MOS ohrabrujući te da bi trebalo istražiti i potencijale β-glukana, prvo u in vitro uvjetima, a potom u kontroliranom terenskom pokusu provjeriti njegovu primjenjljivost kao nutraceutika i MIO, napose u preventivi i kontroli crijevnih infekcija bakterijske etiologije u odbijene prasadi. To nam svakako nalažu suvremeni trendovi u veterinarskoj imunologiji, napose nutritivnoj imunomodulaciji, kao i u zdravlju stada, napose zdravlju probavnog sustava svinja.
Naime, znanost je u području veterinarske medicine, napose u traganju za prirodnim alternativama antibiotskim promotorima rasta u hrani, izuzetno propulzivna to se pojavljuju brojna izvješća o učincima derivata kvasaca, glukanima i mananima (Kogan i Kocher, 2007.), o iscrpcima iz algi (Turner i sur., 2002.), zeljastih ili drvenastih biljaka, fitobioticima (Windisch i sur., 2008.) te o učincima životinjskih proizvoda kao što su svinjska plazma (Gallois i Oswald, 2008.), goveđi kolostrum (Boudry i sur., 2007.) i laktoferin (Shan i sur., 2007.) na proizvodne i imunosne pokazatelje u svinje. U ovom smo radu naveli samo učinke pripravaka β-D-glukana (tablica 1) i α-D-manana ili MOS (Tablica 2), koji tvore oko 90% stanične stijenke kvasaca, i imaju izuzetne osobitosti da djeluju kao MIO na imunosni sustav domaćina.
LPS = lipopolisaharid iz stanične stijenke bakterije Escherichia coli;
PGM = peptidoglikan monomer iz stanične stijenke bakterije Brevibacterium divaricatum;
PGP = peptidoglikan polimer iz stanične stijenke bakterije B. divaricatum;
LTPS = limfatička tkiva probavnog sustava (lamina propria jejunuma; LPJ, Peyerove ploče ileuma; PPI, mezenterijski limfni čvor; MLČ);
ETEC = enterotoksigeni soj bakterije E. coli;
MDP = muramil dipeptid sintetički analog molekula iz Wax D sastavnice plazmatske mebrane mikobakterija;
MOS = mananoligosaharid iz stanične stijenke pekarskog kvasca S. cerevisiae;
IFP = interfolikularna područja;
MOS = mananoligosaharid.
Shodno tomu, danas su dostupni brojni komercijalni pripravci tih polisaharida kao dodatci hrani za prasad. Međutim, sastav i čistoća tih pripravaka često su nepoznati. Time se djelomično može objasniti veliki raspon koncentracije, napose β-glukana u hrani, s faktorom od 1 do 500 pa stoga i ne čude prilično oprečni podatci o njegovom učinku kao MIO. Naime, neki autori smatraju da pripravci zbog peroralnog načina unosa nisu dospjeli u dodir s imunosnim stanicama, da nisu uporabljeni u djelatnoj koncentraciji ili da nisu davani pravovremeno (Gallois i sur., 2009.). Isto tako kinetika njihova metaboliziranja nije poznata. Unatoč svim ovim nepoznanicama, i dalje ostaje činjenica da će zbog nadolazeće globalizacije napuštanja antibiotskih dodataka hrani, uporaba MIO, a napose onih prirodnog podrijetla, kao što su β-glukan i postati medicinski vrlo zanimljiva i gospodarski opravdana ukoliko bude znanstveno dokazana njihova djelotvornost.
Stoga o skoroj uporabi β-glukana u veterinarskoj medicini, napose u nespecifičnoj imunoprofilaksi i/ili imunoterapiji u mnoštvenim uzgojima svinja, premda postoje i kontroverzna izvješća (Dritz i sur., 1995., Decuypere i sur., 1998., Hiss i Sauerwein, 2003.), ne bi trebalo dvojiti s obzirom na njegovu učinkovitost kao nutraceutika i imunomodulatora (Tablica 1), ali se nameće pitanje njegove isplativosti.
Međutim, nedavno je skrenuta pozornost s uobičajenog postupka izdvajanja beta glukana iz pekarskog kvasca (Hromadkova i sur., 2003.) na poznatu mogućnost izdvajanja iz biomase iskorištenog pivskog kvasca (Liu i sur., 2008.) radi njegove racionalne i rentabilne primjene u veterinarskoj medicini, napose kao dodatka stočnoj hrani (Petravić-Tominac i sur., 2009.).
Slijedom toga, smatramo da bi ovako izdvojeni β-glukan, nakon povoljnog poredbenog in vivo i in vitro testiranja djelotvornosti s β- glukanom izdvojenim iz pekarskog kvasca, mogao postati alternativa antibioticima u hrani, napose u kritičnim razdobljima intenzivne animalne proizvodnje kao što su porođaj, odbiće, pregrupiranje, preseljenje, promjene mikroklimatskih uvjeta ili načina držanja, transport i druga stresna stanja u mnoštvenim uzgojima domaćih životinja, napose svinja.
Zaključne pripomene
Treba svakako pripomenuti da imunomodulacijske osobitosti β-glukana nisu nedvojbeno dokazane i da su stoga njegovi učinci kao MIO nepredvidivi, a njegov potencijal kao nutraceutika nije pouzdan. Zato su nužna daljnja istraživanja, a napose u in vitro uvjetima sa standardiziranim pripravcima β-glukana radi vjerodostojnije provjere njihovih učinaka u in vitro uvjetima.
Međutim, kada se sveobuhvatno razmotre sve znanstveno utemeljene činjenice o djelovanju β-glukana (i MOS) na otpornost, dobrobit i zdravlje životinja može se zaključiti da ostvaruju povoljne učinke na zdravlje (posebice probavnog sustava) i proizvodnost prasadi preko barem tri mehanizma:
- vezanjem za ugljikohidratne fimbrijske adhezine crijevnih bakterija i posljedičnim blokiranjem prianjanja uzročnika za enterocitne, također ugljikohidratne receptore;
- adsorbiranjem bakterijskih toksina (i mikotoksina iz hrane) i inhibiranjem njihova toksičnog djelovanja
- aktivacijom dendritičkih stanica/makrofaga i limfocita u PP, nakon transcitoze kroz M stanice, što dovodi do poticanja mukozne imunosti i zaštite organizma od crijevnih patogenih bakterija.
Umjesto zaključka, ističemo da se povoljni učinci polisaharidnih dodataka hrani na poticanje imunosnih odgovora u LTPS trebaju ubuduće dostatnije dokumentirati s obzirom na činjenicu da se njihovi učinci uglavnom očekuju u tom odjeljku imunosnog sustava. Istovremeno, potrebna su i farmakokinetička istraživanja radi utvrđivanja sudbine tih molekula u organizmu, mjesta njihova djelovanja i bioloških učinaka. Napokon, mora se točno utvrditi povezanost imunomodulacije tim spojevima sa zdravstvenim statusom životinje, jer je konačni cilj uporabe tih spojeva u nutritivnoj imunomodulaciji održavanje zdravlja i unapređivanje proizvodnosti prasadi.
Sažetak
Već je gotovo pet godina (od 2006.) u Europskoj Uniji na snazi zabrana dodavanja subterapijskih doza antibiotika kao promotora rasta u hranu za životinje namijenjene ljudskoj prehrani. Prilagođavanje na povlačenje antibiotika iz nekliničke uporabe iziskuje žurno utvrđivanje relevantnih zdravstvenih kriterija i donošenje znanstveno utemeljenih alternativnih strategija antibioticima u hrani.
Od 1980.-tih pojavljuju se zanimljiva izvješća o brojnim prirodnim ili sintetičkim tvarima koje mogu uspostaviti oštećenu imunosnu funkciju ili pojačati nespecifičnu i specifičnu imunost u domaćih životinja namijenjenih ljudskoj prehrani pa stoga djeluju kao imunomodulatori.
S porastom znanja o imunosnom sustavu i njegovoj endogenoj modulaciji, postalo je jasno da je egzogena imunomodulacija važan profilaktički i terapeutski pristup u preventivi i liječenju različitih bolesti životinja s pomoću široke lepeze imunomodulacijskih tvari, u novije vrijeme nazvanih modifikatorima imunosnog odgovora (MIO).
Zajedničkim djelovanjem temeljnih i kliničkih veterinarskih imunologa, uzgajivača stoke i proizvođača krmnih smjesa, imunomodulacija bi u veterinarsku medicinu mogla unijeti novi kurativni zamah sličan onom koji su svojevremeno učinili antibiotici u borbi protiv infekcijskih bolesti. Međutim, nužno je odabrati potpuno provjerene MIO koji mogu djelovati kao nespecifični pojačivači imunosnog odgovora ili sinergistički kao adjuvansi s cjepivima.
U prirodi prisutne molekule, dugo poznate kao MIO su glukani, polisaharidi izdvojeni iz pekarskog kvasaca, brojnih vrsta gljiva, morskih steljnjača (kao što su smeđe i dijatomejske alge) te biljaka, posebice trava i nekih bakterija.
U ovom ćemo radu poredbeno analizirati imunomodulacijske osobitosti pripravaka β–glukana podrijetlom iz nekoliko izvora, primijenjenih u različitim koncentracijama u in vivo uvjetima na modelu domaće svinje u odnosu na imunostimulacijske učinke nekih egzogenih MIO mikrobnog podrijetla, istraživanih u nas u in vitro i in vivo uvjetima na sisajućoj i odbijenoj prasadi.
Literatura [… prikaži]
β-glucans: natural immune response modifiers insufficiently known in veterinary medicine
Daniel ŠPOLJARIĆ, DVM, Junior Researcher, Tihana FUMIĆ, DVM, Dubravko KEZIĆ, DVM, Junior Researcher, Hrvoje VALPOTIĆ, DVM, PhD, Senior Assistant, Maja POPOVIĆ, DVM, PhD, Full Professor, Ivica VALPOTIĆ, BSc, PhD, Full Professor, Vesna FABIJANIĆ, BSc, Bartul Kašić Secondary School, Pag; Srećko SLADOLJEV, BSc, PhD, Immunology Institute, Zagreb; Gordan MRŠIĆ, BSc, University Study Centre for Forensic Sciences, Split
Since 2006, European-wide directives have restricted the non-clinical use of antibiotics as in-feed growth promoters in food animal production. To accommodate the withdrawal of antibiotics, it is now becoming urgent to provide relevant health criteria and scientifically founded recommendations for alternatives to in-feed antibiotics. Since the 1980s, intriguing reports have appeared, suggesting that a vast variety of substances, either of natural or synthetic origin, can restore or stimulate nonspecific and specific immunity in domestic food animals and, hence, act as immunomodulators. With the growing knowledge of the immune system and its endogenous modulation, it is clear that exogenous immunomodulation represents an important prophylactic and therapeutic approach in the prevention and treatment of various animal diseases using the broad spectrum of immunomodulating agents recently termed as immune response modifiers (IRMs). Through the combined efforts of basic and clinical veterinary immunologists, animal producers and feed manufacturers, immunomodulation will bring into veterinary medicine the same type of curative revolution as antibiotics have in combating infectious diseases. However, it is essential to select fully evaluated IRMs which may act either as nonspecific immunopotentiators or synergistically as adjuvants with vaccines.
Glucans, polysaccharides isolated from yeast species, numerous fungi, seaweeds (such as brown algae and diatoms) and plants, particularly grasses, and from certain bacteria are naturally occurring molecules with a long history as IRMs. The current study gives a comparative analysis of the immunomodulating properties of β-glucan preparations originating from several sources applied in vivo in different concentrations using domestic swine as a model organism in relation to the immunostimulatory effects of some exogenous IRMs of microbial origin tested in vitro and in vivo on suckling and weaned pigs in our laboratory.