Indukcija estrusa u kuja (*)

Darko Gereš¹, Silvio Vince¹, Koraljka Crnković¹, Branimira Špoljarić¹
¹ Klinika za porodništvo i reprodukciju, Veterinarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu
² Udruga “Silver”

Izlaganje sa skupa VETERINARSKI DANI 2013

SAŽETAK

Prof. dr. sc. Darko Gereš, Veterinarski fakultet u Zagrebu
Istraživana je učinkovitost kombinirane primjene eCG (PMSG; seruma ždrebnih kobila; konjskog korionskog gonadotropina) i hCG (korionskog gonadotropina žena) u indukciji fertilnog estrusa u zdravih kuja. Sedamnaest kuja u kasnom anestrusu podijeljeno je u dvije skupine. [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upis Kujama iz skupine B anestrus je utvrđen anamnestički iz podataka o prethodnom estrusu te potvrđen citološki. Devet od jedanaest (9/11; 81,81%) kuja iz skupine A imale su izražen estrus, a svega jedna iz skupine B (1/6; 16,66%) (P<0.01). Interval od aplikacije do početka estrusa u 3 kuje iz skupine A bio je 6 dana (postotak zrelih, kornificiranih stanica (80-90%), u tri kuje 12 dana (80-90%), jedne 18 (90%), jedne 24 (80%) i jedne 28 (80%). Prosječno median vrijeme od aplikacije do početka estrusa u kuja skupine A iznosilo je 12,0±7,3 dana.

Prosječna koncentracija serumskog progesterona P4 u skupini A prije tretmana bila je 0,68±0,54 ng/ml, a poslije 5,04±0,54 ng/ml. Prosječni interval od početka tretmana do prvog dana diestrusa u skupini A bio je 19,4 dana. Od ukupno 9 kuja iz skupine A koje su se parile (n=4) ili su UO (n=5), u 55,56% (5/9) je dijagnosticirana skotnost i sve su oštenile. Od 5 umjetno osjemenjenih kuja 3 su se oštenile (3/5, 60%), a od 4 prirodno pripuštene, dvije su se oštenile (2/4; 50%). Cilj istraživanja bio je dokazati učinkovitost kombiniranog protokola (5 dana eCG i šesti dan hCG) u indukciji fertilnog estrusa.

Istraživanjem je dokazana učinkovitost indukcijskog protokola kombiniranog tretmana eCG, 20IU/kg, tijekom 5 dana i šestog dana hCG (1500 IU) u zdravih kuja u kasnom anestrusu.
Ključne riječi: indukcija, estrus, kuja, hCG/eCG

Uvod

Indikacije za indukciju estrusa u kuja su brojne, od mogućih poremećaja u rasplođivanju, izostanku koncepcije i prvenstveno liječenje primarnih i sekundarnih anestrija, poboljšanje plodnosti, odnosno češće polučivanje većih legala i konačno sinkronizacija ovulacije u postupku embriotransfera. Kuje su životinje sa dominantno sezonski monoestričnim ciklusom (VERSTEGEN et al., 1999a). Ciklus se javlja najčešće jedanput, ali moguće dvaput čak triput godišnje, a kuje spontano ovuliraju jedanput ili dvaput u bilo koje doba godine. Točnije je reći kako se ciklus u kuja javlja tijekom cijele godine, iako je vrhunac sezone kasno zimi i u rano proljeće. Postoje i iznimke, poput pasa pasmine Tibetski mastif i Basenji, koji imaju jednu sezonu, poput mačaka (FULLER, 1956; JOHANNES, 2003).

Trajanje ciklusa dulje je nego u većine domaćih životinja, a posebnost je što poslije lutealne faze, koja traje prosječno 65 dana, slijedi 5-6 mjeseci dugo razdoblje anestrije.

U prosjeku, proestrus nastupa otprilike svakih sedam mjeseci, budući interestrus obično traje 5-11 mjeseci. Može biti kraći od 3,5 mjeseca, ali i dulji od 13 mjeseci, premda su intervali kraći od 4 mjeseca i dulji od 12 mjeseci u pravilu posljedica smanjene plodnosti ili neplodnosti (VERSTEGEN i sur., 1999a; FELDMAN i NELSON, 2004; ROMAGNOLI 2008; ENGLAND i RUSSO, 2009; CONCANNON, 2011).

Interestrus je vrijeme od početka proestrusa do sljedećeg početka estrusa i uključuje proestrus, estrus, diestrus i obligatni anestrus. U nekih je kuja estrus slabije izražen zbog produljenog interestrusa (persistentnog anestrusa). Interestrus prosječno traje 31 tjedan (16 do 56 tjedana) (ROWLANDS, 1950; CHRISTIE i BELL, 1971), a u kuja sa duljim interestrusom smanjena je fertilnost (CHAKRABORTY i sur., 1982).

Čimbenici koji prekidaju anestrus i potiču estrus nisu sasvim razjašnjeni, ali u kuja na prijelazu iz ranog u kasni anestrus povišena je amplituda i frekvencija pulzacije hipotalamičkog gonadotropnog rilizing hormona (GnRH), kao i senzibilnost hipofize prema GnRH, prema tome i jajnički odgovor u vidu otpuštanja luteinizirajućeg (LH) i folikulo-stimulirajućeg (FSH) hormona (JEFFCOATE,1993; Van HAAFTEN i sur., 1994; TANI i sur., 1996). Koncentracija serumskog FSH povišena je kroz najveći dio anestrusa dok je razina LH niska sve do kraja anestrusa. Taj porast bazalne koncentraccijae FSH odlučujući je za početak folikulogeneze, pri čemu FSH potiče ekspresiju LH receptora u granuloza stanicama jajnika. Nakon inicijalne folikulogeneze, LH progresivno nastoji zamijeniti FSH u procesu maturacije folikula (CONCANNON, 1993; MONNIAUX i sur., 1997; KOOISTRA i sur., 1999; ONCLIN i sur., 2001).

Anestrija može biti primarna (u kuja koje nikada nisu imale ciklus) i sekundarna (kuje koje su u prošlosti imale ciklus ili više njih ali su naknadno postale anestrične).
Često, zbog dugog trajanja interestrusa, vlasnici žele indukciju estrusa, međutim ona se prakticira samo u slučaju fiziološkog ciklusa bez funkcionalnih poremećaja, bez razvojnih ili stečenih abnormalnosti. Upravo zbog dugog perioda anestrije, koji uvijek slijedi lutealnu fazu, za razliku od drugih domaćih životinja, estrus u kuja nije moguće inducirati skraćenjem lutealne faze prostaglandinom (FELDMAN i NELSON, 2004b; EILTS, 2010). Brojne su metode indukcije uporabom različitih egzogenih hormona, ali i njihove kombinacije sa drugim supstancama. [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upis U kuja je prolaktin važan u interestrusu, jer vjerojatno uzrokuje sekreciju GnRH, ili jajnički odgovor na gonadotropni podražaj.

[Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upis

Naravno da je indukcija najuspješnija u kuja sa fiziološkim, zdravim ciklusom, dok je učinkovitost u kuja s reprodukcijskim poremećajima diskutabilna. Važno je voditi računa da se histološke promjene, slične involuciji, odvijaju i u negravidnom ciklusu.
Dakle, i u negravidnih kuja reparacija endometrija je inkompletna unutar 135 dana nakon estrusa, (ANDERSON i SIMPSON, 1973). CHAKRABORTY i sur. (1982) su dokazali da je indukcija fertilnog estrusa ugrožena kada započne prije 4. mjeseca od početka zadnjeg proestrusa (ANDERSON i SIMPSON, 1973).
Egzogeni LH i FSH u farmakološkim dozama (svaki zasebno ili zajedno) induciraju estrus. Ipak, nisu bili učinkoviti (CONCANNON, 1993; SHILLE i sur., 1984).
Kombinirana primjena PMSG i hCG apliciranih svaki zasebno, rezultirala je stopom štenjenja od 50-84% (SCROGIE, 1939; BARDENS, 1971; TAKEISHI i sur., 1976; NICKSON i sur., 1992).

MATERIJAL I METODE

Istraživanje je provedeno na 17 zdravih kuja u kasnom anestrusu. Kuje su bile različitih, pasmina: 8 labradora, 4 retrivera, 2 staford terijera te po jedna pasmine bokser, njemački ovčar i buldog. Kuje su bile u dobi od 3 do 6 godina.
Kuje korištene u pokusu bile su pacijenti Klinike (9) te iz privatne prakse (8).
Kuje su podijeljene u dvije skupine. [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upis
Svi uzorci krvi su centrifugirani i pohranjeni duboko smrznuti (-20 °C) do analize metodom RIA.
U kuja iz skupine B registrirani su datumi prethodnog estrusa.
U svih kuja načinjena je vaginalna citologija 1. dana pokusa (istovremeno sa uzorkovanjem krvi za P4), a potom sve dok nije temeljem opažanja estrusnog ponašanja i vaginalne citologije ustanovljen estrus, unutar 4., 8., 12., 18., 24., 28. i 32. dana. Citološka pretraga činjena je uzimanjem obriska vatenim štapićem sa eksternalnog cervikalnog porcija. Na predmetnici je načinjen bris koji je fiksiran metanolom 99%. Nakon 2 minute predmetnica je isprana destiliranom vodom i potom prelivena 5% otopinom Giemse. Nakon 10 minuta predmetnica je isprana destiliranom vodom i osušena na zraku. Obojeni obrisci pregledavani su pod malim povećanjem (10-40x).
Kuje koje nisu prirodno parene, umjetno su osjemenjene nativnim sjemenom.
Parenje je trajalo sve dok su kuje ginekološki i citološki bile u požudi i pokazivale interes za mužjaka. Umjetno osjemenjavanje provodilo se polučivanjem sjemena mužjaka manualnom fiksacijom, uz prisustvo ženke sve do završetka estrusa, ustanovljeno ginekološki i eksfolijativnom vaginalnom citologijom te temeljem dana posljednjeg pripusta/osjemenjavanja, odnosno danom kada kuje više nisu bile u požudi.
Podaci su statistički analizirani programskim paketom SAS (SAS 9.2), procedurom MEANS i FREQ za deskriptivnu statistiku te procedurom GLM za analizu P4 prije početka i tijekom tretmana.

REZULTATI

Tablica 1. Vrijeme pripusta/UO i početak diestrusa

Koncentracija serumskog progesterona P4 u skupini A prije tretmana bila je 0,68±0,54 ng/ml, a poslije tretmana 5,04±0,54 ng/ml (p<0,001). Nakon aplikacije eCG/hCG, u devet kuja su se javili izraženi znakovi estrusnog ponašanja (9/11; 81,81%). Prosječno median vrijeme od početka tretmana do početka estrusa bilo je 12,0±7,3 dana.
Citološki nalaz bio je na početku aplikacija identičan u svih kuja iz obje skupine. Nakon aplikacija, devet od jedanaest (9/11; 81,81%) kuja i z skupine A imale su izražen estrus, a svega jedna iz skupine B (1/6; 16,66%) što je iznosilo p<0,01.

Grafikon 1. Prikaz koncentracije P4 tijekom postupka

DISKUSIJA

Serum ždrebnih kobila (PMSG ili točnije eCG) u kombinaciji sa korionskim gonadotropinom gravidnih žena (hCG) u gotovom industrijskom pripravku nije pogodan za kuje jer podrazumijeva istovremenu primjenu oba hormona (PG600R, Intervet). [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upisU pokusu od devet kuja koje su parene ili umjetno osjemenjene, 55,56% (5/9) se oštenilo.
PMSG je najčešće korišten gonadotropin za indukciju estrusa jer se pokazao učinkovitiji nego FSH. [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upisJoš je jedan problem nazočan, a to je nepredvidivost reakcije kuje. Naime, moguće je da će se razviti pretjeran broj folikula, što u kuja može izazvati alergiju i može izazvati preuranjenu luteolizu (BARTA i sur.,1982; CARTER, 1980; GREENBLATT i PUND, 1941). Za razliku od tog pripravka, kombinacija PMSG i hCG rezultirala je visokom koncepcijom i stopom štenjenja od od 50–84% (NICKSON i sur.,1992; TAKEISHI i sur., 1976). To potvrđuju i rezultati istraživanja prema kojem je 55,56% kuja koncipiralo i oštenilo se. Problem što PMSG nekontrolirano uzrokuje razvoj velikog broja folikula (superovulaciju) i kako se radi o biološkim pripravcima, moguću alergijsku reakciju te prematurni lutealni defekt. Tako je zabilježen i slučaj bokserice sa jakom alergijskom reakcijom nakon druge injekcije PG600, čak i slučaj kuje koja je neočekivano uginula nakon tretmana (GREENBLATT i PUND, 1941; CARTER, 1980).

U pokusu je anamnestički, citološki i mjerenjem razine P4 utvrđen kasni anestrus i to je bilo polazište, jer je postupak indiciran samo u kuja sa trajanjem anestrusa duljim od 31-nog tjedna (OKKENS i KOOISTRA, 2006; ANDERSON i SIMPSON, 1973).

Učinak postupka u kojem se 5 od 9 tretiranih kuja (55,56%) oštenilo na donjoj je granici u usporedbi sa najboljim rezultatima autora koji su primijenili identične pripravke, ali u drugačijim modalitetima i čiji su se rezultati kretali od 50-84% (BARDENS, 1971; TAKEISHI i sur., 1976; NICKSON i sur., 1992). [Ovdje se nalazi sadržaj dostupan samo veterinarima prijavljenima u VetBook.]
...prijava ...upis Tome u prilog govori i raniji nastup estrusa i diestrusa u istraživanju citiranih autora u odnosu na naš pokus.

ZAKLJUČAK

Brojni su protokoli za indukciju estrusa u kuja, međutim rezultat i uspjeh indukcije, ovulacije i konačnog rezultata, štenjenja, signifikantno variraju ne samo kod različitih protokola već i unutar jednakih protokola. U našem istraživanju učinak je u odnosu na ukupnu učinkovitost indukcijskih protokola zadovoljavajući, ali zahtijeva izmjene u načinu i doziranju eCG.

Literatura [… prikaži]

ANDERSON, A.C., SIMPSON, M.E. (1973): The ovary and reproductive cycle of the dog (Beagle). Los Altos, CA, Geron-X Inc.
ARBEITER, K., BRASS, W. BALLABIO, R., JOCHLE, W. (1988): Treatment of pseudopregnancy in the bitches with cabergoline – an ergoline derivative. J. Small Anim. Pract. 29, 781-788.
BARDENS, J.W. (1971): Hormonal therapy for ovarian and testicular dysfunction in the dog. J Am Vet Med Assoc, 159:1405.
BARTA, M., ARCHIBALD, L.F, GODKE, R.A. (1982): Luteal function of induced corpora lutea in the bitch. Theriogenology18, 541-549.
BOUCHARD, G., YOUNGQUIST, R.S., CLARK, B., CONCANNON, P.W., BRAUNN, W.F. (1991): Estrus induction in the bitch using a combination diethylstilbesterol and FSH-P. Theriogenology, 36, 51–65
BOUCHARD, G.F., GROSS, S., GANJAM, V.K., YOUNGQUIST, R.S., CONCANNON, P.W., KRAUSE, G.F. (1993): Oestrus induction in the bitch with the synthetic oestrogen diethylstilbesterol. J Reprod. Fertil. (Suppl.). 47, 515-516.
CARTER, J.G. (1980): Hormone treatment for nonproductive bitches. Can Vet J , 21, 185.
CHAKRABORTY, P.K, WILD, D.E., SEAGER, S.W.J. (1982): Induction of estrus and ovulation in the cat and dog. Vet Clin North Am Small Anim Pract.12, 85-91.
CHRISTIE, D.W., BELL, E.T. (1971): Some observations on the seasonal incidence and frequency of oestrus in breeding bitches in Britain. J Sm Anim Pract, 12, 159-167.
CONCANNON, P.W.: Methods for rapid induction of fertile oestrus in dogs. In: Kirk’s Current Veterinary Therapy: Small Animal Practice (eds. Kirk, R.W. and Bonagura, J.D.), W.B.Saunders Company, Philadelphia, 960-963 (1992).
CONCANNON, P.W. (1993): Biology of gonadotropin secretion in adult and prepubertal female dogs. J Reprod Fertil Suppl 47, 3-27.
CONCANNON, P.W. (2011): Reproductive cycles of the domestic bitch. Anim Reprod Sci. 124(3-4), 200-210.
EILTS, E.B.: Contraception and Pregnancy Termination in the Dog and Cat. U: Ettinger, S.J. i E.C. Feldman: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Seventh edition. Saunders Elsevier,St Luis, Missouri, Volume 2, Section XVIII, Ch. 301, 1906-1913, (2010).
ENGLAND, C.W., RUSSO, M.: Breeding Management of the bitch. U: Bonagura, J.D., D.C. Twedt (Ur): Kirk’s Current Veterinary Therapy, XIV izdanje, Sekcija X, Ch. 210, 974-979
(2009).
FELDMAN, E.C., R.W. NELSON: Ovarian cycle and vaginal cytology. U: Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. Third edition. W. B. Saunders Co., Philadelphia, 752-774 (2004a).
FELDMAN, E.C., R.W. NELSON: Infertility, associated breeding disorders, and disorders of sexual development. U: Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. Third edition. W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 868-900 (2004b).
FULLER, J.L (1956): Photoperioidic control of estrus in the Basenji. J Hered. 179-180.
GREENBLATT, R.B., PUND, E.R. (1941): The gonadotrophins: a clinical and experimental study. South Med J , 36, 730-742.
HARVEY, M.J., DALE, M.J., LINDLEY, S., WATERSTON, M.M. (1999): A study of the aetiology of pseudopregnancy in the bitch and the effect of cabergoline therapy. Vet. Rec. 144, 433-436.
JEFFCOAT, A. (1993): Endocrinology of anestrous bitches. J Reprod Fertil Suppl, 47, 69–67.
JOCHLE, W., BALLABIO, R., DISALLE, E. (1987): Inhibition of lactation in the Beagle bitch with the prolcatin inhibitor cabergoline (FCE 21336): Dose response and aspects of long term safety. Theriogenology. 27, 799-811
JOHANNES, J.E. (2003): The Basenji Annual Estrus: Controlled by Short-day photoperiod. The Basenji. 39(5), 12-13.
KOOISTRA, H.S., OKKENS, A.C., BEVERS,M.M., POPP-SNIJDERS, P., Van HAAFTEN, B., DIELEMAN, S.J., SCHOEMAKER, J. (1999): Concurrent pulsatile secretion of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone during different phases of the estrous cycle and anestrus in beagle bitches. Biol Reprod, 60, 65-71.
KUTZLER, M.A. (2007): Estrus induction and synchronization in canids and felids. Theriogenology. 68, 354-374.
MONNIAUX, D., HUET, C., BESNARD, N., CLEMENT, F., MARIANA, J.C., BOSC, M., MONGET, P. (1997): Follicular growth and ovarian dynamics in mammals. J Reprod Fertil Suppl 51, 3-23.
NICKSON, D., RENTON, J.P., HARVEY, M.J.A., BOYD, J.S., FERGUSON, J.M., ECKERSALL, P.D. (1992): Oestrus induction in the bitch. Proc 12th Int Cong Anim Reprod, 4, 1799–1801.
OKKENS, A.C., KOOISTRA, H.S. (2006): Anoestrus in the dog: a fascinating story. Reprod Dom Anim, 41, 291-296.
ONCLIN, K, LAUWERS, F., VERSTEGEN, J.P. (2001): FSH secretion patterns during pregnant and nonpregnant luteal periods and 24h secretion patterns in male and female dogs. J Reprod Fertil Suppl 57, 15-21.
PHILLIPS, T.C., LARSEN, R.E., HERNANDEZ, J., STRACHEN, L., SAMUELSON, D., SHILLE, W.M., ARCHIBALD, L.F. (2003): Selective control of oestrous cycle of the dog through the suppression of oestrus and reduction of the length of anoestrus. Theriogenology 59, 1441-1448
ROMAGNOLI, S. (2008): Reproduction Infertility in the Bitch. Proceeding of the SEVC Southern European Veterinary Conference, Oct. 17-19, Barcelona, Spain.
ROWLAND, I.W. (1959): Some observations on the breeding of dogs. Proceedings from the Conference of the Society for the Study of Fertility (London) 2, 40-55.
SCROGIE, N.J. (1939): The treatment of sterility in the bitch by use of gonadotrophic hormones. Vet Rec 51, 265-268.
SHILLE, V.M., THATCHER, M.J., SIMMONS, K.J. (1984): Efforts to induce estrus in the bitch, using pituitary gonadotropins. J Am Vet Med Assoc 184, 1469-1473.
STORNELLI, M.C., STORNELLI, M.A., SAVIGNONE, C.A., GARCÍA MITACEK, M.C., TITTARELLI, C.M., VIDELA DORNA, I., DE LA SOTA, R.L.: Induction of fertile estrus in bitches using eCG followed by hCG. Conferencia; Annual Conference of the Society for Theriogenology (2009).
STORNELLI, M.C.,GARCÍA MITACEK, M.C., GIMÉNEZ, F., BONAURA, M.C.,VIDELA DORNA, I., DE LA SOTA, R.L.,STORNELLI, M.A.(2012): Pharmacokinetics of eCG and induction of fertile estrus in bitches using eCG followed by hCG. Theriogenology 78, (1056-1056).
TAKEISHI, M., KODOMA, Y., MIKAMI, T., TUNEKANE, T., IWAKI, T. (1976): Studies on reproduction in the dog. XI. Induction of estrus by hormonal treatment and results of the following insemination. Jap J Anim Reprod 22(2),71-75.
TANI, H., INABA, T., TAMADA, H., SAWADA, T., MORI, J., TORI, R. (1996): Increasing gonadotropin-releasing hormone release by perfused hypothalamus from early to late anestrus in the beagle bitch. Neurosci Lett, 207, 1–4.
VANDERLIP, S.L., WING, A.E., FELT, P., LINKIE, D., RIVIER, J., CONCANNON, P.W., LASLEY, B.L. (1987): Ovulation induction in anestrus bitches by pulsatile administration of gonadotropin-releasing hormone. Lab Anim Sci 37, 459-464.
Van HAAFTEN, B, BEVERS, M.M., Van den BROM, W.E., OKKENS, A.C., Van SLUIJS, F.J., WILLEMSE, A.H., DIELEMANN, S.J. (1994): Increasing sensitivity of the pituitary to GnRH from early to late anoestrus in the beagle bitch. J Reprod Fertil 101, 221-225.
VERSTEGEN, J.P., ONCLIN, K., SILVA, L.D.M., CONCANNON, P.W. (1999): Effect of stage of anoestrus on the induction of estrus by the dopamine agonist cabergoline in dogs. Theriogenology 51, 597-611.