Aflatoksin M1 u mlijeku i mliječnim proizvodima

Nina Bilandžić, Ivana Varenina, Đurđica Božić, Marija Sedak, Maja Đokić, Božica Solomun Kolanović i Ž. Cvetnić
Dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, Ivana VARENINA, dipl. ing. biotehnol., Đurđica BOŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., Marija SEDAK, dipl. ing. prehr. tehnol., Maja ĐOKIĆ, dipl. ing. kem. tehnol., Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, dipl. ing. biotehnol., dr. sc. Željko Cvetnić, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, izvanredni profesor, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb

Prenešeno iz časopisa VETERINARSKA STANICA br.3/2013.[download/preuzmi pdf ovdje]

Uvod

Mikotoksini su toksične tvari koje nastaju metabolizmom pojedinih gljiva (Aspergillus, Stachyobotris, Penicillium, Fusarium, Cephalosporium, itd.). Rast gljivica i stvaranje mikotoksina može se pojaviti u brojnim biljnim vrstama što može predstavljati ozbiljne rizike za zdravlje ljudi i životinja (Yannikuoris i Jouany, 2002.). U povoljnim uvjetima za razvoj gljivica, mikotoksini mogu nastati tijekom bilo koje faze proizvodnje i transformacije u prehrambeni proizvod (Slika 1). Prema tome, mikotoksini mogu biti proizvedeni u biljkama zaraženim u polju, tijekom žetve, tijekom skladištenja i prijevoza, tijekom tehnološke transformacije i pri pripremi hrane (Husein i Brasel, 2001.).
Najčešće analizirani mikotoksini u hrani su aflatoksini, okratoksin (OTA), zearalenon (ZEA) i deoksivalenola (DON).
Međutim, samo aflatoksini su podvrgnuti zakonskim ograničenjima u hrani za životinje. Poznato je 18 aflatoksina, a najvažniji predstavnici su aflatoksini B1, B2, G1, G2, pronađeni u hrani i krmivima te M1, M2 kao metabolički produkti aflatoksina B1 i B2 pronađeni u mlijeku i mliječnim proizvodima (Heshmati i Milani, 2010.) (Slika 2).

Aflatoksini su izrazito toksični, mutageni, teratogeni i karcinogeni spojevi, a aflatoksin B1 je najsnažniji poznati karcinogen. Unešeni u organizam mogu biti aktivirani ili inaktivirani mikrosomskim oksidazama i izazvati toksično oštećenje jetre, a ponekad i drugih organa. Istraživanja načina djelovanja aflatoksina B1 otkrila su njegov inhibicijski učinak na replikaciju DNK i RNK te na sintezu proteina, ali su dokazani i objavljeni učinci i na citoplazmene membrane i na put oksidativne fosforilacije (Duraković i Duraković, 2003.).
Utvrđivanje prisutnosti aflatoksina u hrani za životinje je važno zbog moguće kontaminacije mlijeka u životinja hranjenih s aflatoksin-kontaminiranom hranom.

Legislativa za aflatoksine

Kao najjači karcinogen s toksičnim utjecajem aflatoksin B1 na ljude djeluje putem izravne konzumacije preko hrane ili kao metabolički zaostatak u hrani životinjskog podrijetla. Različitim pravilnicima su dane najviše dopuštene količine aflatoksina u hrani te hrani za životinje. Aflatoksini su moćni karcinogeni, teratogeni i mutageni, a aflatoksin B1 ima visoku stopu toksičnosti za životinje, nakon čega slijede aflatoksini M1, G1, B2 i G2 (Gourama i Bullerman, 1995.).
Međunarodna agencija za istraživanje raka (IARC) klasificirala je aflatoksin B1 koji se smatra najmoćnijim hepatokarcinogenim agensom u sisavaca u skupinu 1- klasa agenasa koji su svakako karcinogeni za ljude. Aflatoksin M1 je s druge strane klasificiran u dio grupe 2B, kao agens koji je eventualno karcinogen u ljudi (IARC, 1993., Maurice, 2002.).
U Hrvatskoj je Ministarstvo poljoprivrede izdalo Pravilnik o najvećim dopuštenim količinama određenih kontaminanata u hrani (NN 146/2012.) prema europskoj direktivi 466/2001/EC (EC, 2001.). Primjerice najviše dopuštene količine (NDK) aflatoksina B1 su za različite vrste hrane: 8 μg/kg za bademe, pistacije i koštice marelice namijenjenih za prehranu ljudi; 2 μg/kg za kikiriki, lješnjak i sušeno voće te žitarice i proizvode od žitarica; 5,0 μg/kg za kukuruz i rižu koji se sortiraju i drugačije fizikalno obrađuju prije uporabe za prehranu ljudi ili kao sastojak hrane. Niže vrijednosti za B1 od 0,1 μg/ kg su određene za dječju hranu te za prerađenu hranu na bazi žitarica i hranu za dojenčad i malu djecu.
NDK za aflatoksin M1 za sirovo mlijeko, toplinski obrađeno mlijeko i mlijeko za proizvodnju mliječnih proizvoda je 0,05 μg/kg (50 ng/kg). Za početnu i prijelaznu hranu za dojenčad, uključujući početno i prijelazno mlijeko za dojenčad te hranu za posebne medicinske potrebe namijenjenu posebno dojenčadi NDK je 0,025 μg/kg aflatoksina M1.
Nadzor nad hranom za životinje provodi se prema Pravilniku o nepoželjnim tvarima u hrani za životinje (Pravilnik 80/2010.) načinjen je prema direktivi 2003/100/EC (EC, 2003.). Ovaj Pravilnik daje posebnu pozornost na koncentracije aflatoksina B1 u hrani za životinje obzirom na vrstu i starost životinja te životinje za proizvodnju mlijeka, odnosno obzirom na sirovine kada je udio vlage u hrani za životinje, preračunat na 12% (potpune i dopunske hrane). NDK za potpune krmne smjese za životinje za proizvodnju mlijeka je 5 μg/kg aflatoksina B1.

Aflatoksin M1

Aflatoksin M1 je hepatokarcinogeni metabolit, dobiven hidroksilacijom aflatoksina B1 pronađen u mlijeku krava koje su konzumirale hranu zagađenu aflatoksinom B1. Stopa apsorpcije aflatoksina i izlučivanje aflatoksina M1 u mlijeku, varira između pojedinih životinja, iz dana u dan te od jedne do druge mužnje.
Nakon izloženosti životinja hranom s aflatoksinom B1 mlijeko je kontaminirano s hidroksil-metabolitom aflatoksina M1 (Veldman i sur., 1992.). Općenito se smatra da se otprilike 1-3% aflatoksina B1 prisutnog u hranjivu životinja pojavljuje kao aflatoksin M1 u mlijeku, što varira od životinje do životinje, vremenu izdavanja mlijeka i mnogim drugim faktorima.
U krava s visokim prinosom mlijeka potrošnja znatno veće količine hrane može dovesti do prijenosa (carry-over) i do 6,2% (EFSA, 2004., Fink-Gremmels, 2008.). Dodatci s konzerviranom krmom, posebno silažom od kukuruza i trave se daju s obzirom na energetske potrebe stada s visokim prinosom mlijeka i smanjenja ispaše tijekom zimskih mjeseci.
Smatra se da proizvodna stada goveda i ovaca koja su na ispaši imaju nizak rizik od kontaminacije. Rizik je u velikoj mjeri vezan na ishranu hranjivima na bazi zrna (Fink-Gremmels, 2008., Duarte i sur., 2013.).
Ako se koristi kontaminirana hrana, aflatoksin M1 će se pojaviti u mlijeku dva do tri dana nakon ingestije. Isto tako dva do tri dana nakon primjene hranidbe bez aflatoksina dolazi do smanjenja koncentracija aflatoksina M1 u mlijeku (Pittet, 1998., Prandini i sur., 2009.).
U odnosu na aflatoksin B1 molekulu, karcinogenost aflatoksina M1 je oko 2-10% izvornog oblika (Creppy, 2002.).
Čovjek može biti izložen aflatoksinu M1 putem endogene proizvodnje ili unosom mliječnim proizvodima. Najviše su izložena dojenčad i djeca, jer su najveći potrošači te namirnice, a ne smije se zanemariti i izlučivanje toksina u mlijeku žena koje doje (Turconi i sur., 2004.).
Aflatoksin M1 je relativno stabilan spoj u sirovom i obrađenom mlijeku na koji ne djeluje postupak pasterizacije ili prerade u sir. Ipak, uslijed njegove slabe topljivosti u maslacu i dobre apsorpcije u skuti, proizvodi kao što su maslac, skuta i sirutka pokazuju odstupanja u sadržaju aflatoksina M1 u odnosu na izvorno mlijeko. Prilikom procesa koji obuhvaćaju izdvajanje masnoće aflatoksin se veže na hidrofobni dio molekule kazeina te time dominira u nemasnim frakcijama (Van Egmond i sur., 1986.).
U sirutki, prilikom proizvodnje sira, razina aflatoksina M1 se kretala od razina koje se ne mogu detektirati do 84,1 ng/kg.
Količina aflatoksina M1 zaostalog u sirutki izražavala se s faktorom obogaćenja, odnosno omjerom količine aflatoksina M1 u sirutki i količine aflatoksina M1 u mlijeku iz koje je proizvedena.
Srednja vrijednost je iznosila 4,9 ng/kg.
Razlog tomu je koncentriranje sirovog mlijeka prilikom proizvodnje (Kaniou- Grigoriadou i sur., 2004.). Tako je na primjer u sirevima u Turskoj u 27,5% uzoraka utvrđena koncentracije iznad 250 ng/kg (Sarimehmetoglu i sur., 2004.).
Određeni znanstveni radovi su pokazali kako postupak sazrijevanja sira utječe na razinu aflatoksina u siru. Utvrđeno je da nakon 2 mjeseca sazrijevanja sira pod kontroliranim uvjetima u uzorcima nije bilo aflatoksina M1 (Kaniou-Grigoriadou i sur., 2004.). Tu činjenicu moguće je povezati sa znanstvenom potvrdom da mikroorganizmi, uključujući bakterije, kvasce, plijesni, aktinomicete i alge, imaju sposobnost ukloniti ili smanjiti razinu aflatoksina u hrani i hranjivima (Ciegler i sur., 1966.).
Spojevi aflatoksina su termostabilni te se pasterizacijom ne mogu reducirati.
Aflatoksini se javljaju i u mlijeku obrađenom ultra-visokim temperaturama (engl. high temperature processing, UHT), fermentiranim proizvodima od mlijeka i to s čimbenikom obogaćenja od 3 do 5 u odnosu na izvorno mlijeko (Pietri i sur., 1997.).
Potvrđeno je da je kontaminacija mlijeka i mliječnih proizvoda i varijacije u koncentracijama povezana s geografskim položajem, dijelom države s obzirom na stupanj razvoja i godišnjim dobom (Celik i sur., 2005.). Također, prijenos aflatoksina od hrane do mlijeka (carry- over) u mliječnih krava je pod utjecajem različitih prehrambenih i fizioloških čimbenika, uključujući i režim hranidbe, stupanj digestije, zdravlje životinja, biotransformacijski kapacitet jetre te proizvodnju mlijeka (Duarte i sur., 2013.).
Hladne i tople sezone utječu na zagađenje aflatoksinima time što su u proljeće i ljeto dostupne svježe namirnice za prehranu stoke kao što su ispaša, trava, korov i sirova hranjiva. U vrijeme hladnih mjeseci puno se češće koriste suha pripremljena hranjiva ili koncentrati. U hrvatskim ruralnim područjima česta je ishrana suhim sijenom koje nepravilnim skladištenjem uz neadekvatne uvjete može rezultirati pojavom aflatoksikotvornih plijesni, a time i zagađenje hranjiva toksinima (Kamkar, 2005.).
Važni činitelji o kojima ovisi razina zagađenja aflatoksinima su temperatura i vlaga. Plijesni kao što su A. flavus i A. parasiticus lako rastu na hranjivima sa sadržajem vlage između 13-18%, a pogodna relativna vlažnost zraka im je između 50 i 85% (Jay, 1992.). Temperatura pogodna za rast je oko 28 °C. Čimbenici kao što su vlažnost zemlje i oštećenje hranjiva koji su prouzročili insekti također povećavaju mogućnost razvoja takvih plijesni (Sarimehmetoglu i sur., 2004.).
Ipak, najčešći razlog zagađenju su i dalje neadekvatni uvjeti skladištenja.
Zato se u Europskoj Uniji i svijetu provode kontrolni planovi čime se nadzire proizvodnja hranjiva za životinje i sadržaj aflatoksima M1 u mlijeku. Veliki dio farmi mliječne industrije koriste silažu sirka kao glavni izvor hrane. Sirak je prosolika žitarica koja dolazi s afričkog i azijskog kontinenta gdje je vlažnost od 85% i temperatura između 27 i 38 °C te je često kontaminirana toksikogenim plijesnima kojima pogoduju takvi uvjeti (Aspergillus) (Da Silva i sur., 2004.).

Analitičke metode za određivanje aflatoksina M1

Najviše dopuštene količine aflatoksina određene brojnim regulativama, kako kod nas tako i u svijetu, usmjerili su laboratorije prema razvijanju točnijih i preciznijih metoda. Na putu namirnica od proizvođača do stola prati se eventualna kontaminacija tijekom proizvodnje primjenom metoda koje su brze i jednostavne za primjenu in situ.
Analiza aflatoksina prvi put je provedena prije 30 godina i to tankoslojnom kromatografijom. Danas se za određivanje aflatoksina koriste imunokemijske metode (ELISA) kao orijentacijski testovi u rutinskim analizama, uglavnom zbog svoje jednostavnosti i brzine te zbog osjetljivosti određivanja manjom od 0,01 μg/L (Kim i sur., 2000., Lopez i sur., 2001., Pei i sur., 2009.). ELISA metode su bazirane na sposobnosti protutijela da razlikuju trodimenzionalnu strukturu mikotoksina. Na tržištu su dostupni različiti jednostavni testovi, brzi i pouzdani za određivanje aflatoksina B1, ukupne aflatoksine i aflatoksin M1.
U slučaju povišenih koncentracija aflatoksina, odnosno pozitivnih rezultata provode se potvrdne metode, koje su daleko osjetljivije i specifičnije te se u tu svrhu koristi tekućinska kromatografija s masenom spektrometrijom te visokodjelotvorna kromatografija s flourescentnom detekcijom (Cavaliere i sur., 2006., Muscarella i sur., 2007.). U svrhu osiguranja kakvoće analitičkih rezultata provode se validacijske studije metoda koje uključuju točnost i preciznost te rutinske kontrole unutar laboratorija koje se zasnivaju na kontrolnim uzorcima.

Koncentracije aflatoksina M1 u mlijeku različitih država

Proveden je niz studija o pojavi aflatoksina M1 u mlijeku posebice u zadnjem desetljeću. U tabeli 1. prikazane su koncentracije aflatoksina M1 u mlijeku različitih zemalja s više kontinenata.

Tabela 1. Koncentracije aflatoksina M1 u različitim zemljama

Istraživanja su pokazala varijacije koncentracija s obzirom na godišnje doba te su potvrdile povećanje koncentracija na više od 50 ng/L u vrijeme hladnih mjeseci kada se koriste hranjiva ili koncentrati (Tajkarimi i sur., 2008., Ruangwises i Ruangwises, 2009., Heshmati i Milani, 2010., Nemati i sur., 2010.).
Srednje koncentracije aflatoksina M1 određene ispod 24 ng/L utvrđene su u sirovom i UHT kravljem mlijeku iz Brazila, Francuske, Hrvatske, Španjolske i Portugala (Shundo i Sabino, 2006., Boudra i sur., 2007., Bilandžić i sur., 2010., Cano-Sancho i sur., 2010., Duarte i sur., 2013.). Međutim, nedavna istraživanja u Hrvatskoj pokazala su koncentracije višestruko veće od 50 ng/L u sirovom mlijeku (neobjavljeni rezultati).
Znatno povišene koncentracije aflatoksina M1 (> 140 ng/L) određene su u sirovom kravljam mlijeku iz Pakistana i Sirije te izuzetno visoke koncentracije od 492 ng/L u pasteriziranom mlijeku iz Sirije (Ghanem i Orfi, 2009., Iqbal i Asi, 2013.).
U zadnjih nekoliko godina prikazane su brojne studije koncentracija aflatoksina M1 u Iranu u kravljem sirovom (Nemati i sur., 2010., Rahimi i sur., 2010.) i pasteriziranom mlijeku (Oveisi i sur., 2007., Ghazani, 2009., Fallah, 2010., Sani i sur., 2010.) srednjih vrijednosti od 52,9 do 74,91 ng/L. Paralelno određivanje koncentracije u ovčjem i kozjem mlijeku pokazalo je koncentracije niže od 31 ng/L (Rahimi i sur., 2010.).
U Brazilu je 20,9% uzoraka kravljeg mlijeka bilo pozitivno, a koncentracije su se kretale u području od 50 do 240 ng/L (Garrido i sur., 2003.). Utvrđene su i povećane koncentracije u kozjem pasteriziranom i UHT mlijeku u 25 odnosno 50% uzoraka (Oliveira i Ferraz, 2007.). U nedavnoj studiji u Brazilu koncentracije u UHT kravljem mlijeku kretale su se čak od 1000 do 4200 ng/L (Oliveira i sur., 2013.).
U europskim zemljama se provode stroge kontrole proizvodnje hranjiva za životinje i planovi praćenja aflatoksina M1 u mlijeku i mliječnim proizvodima, što je razlog niskih razina kontaminacije aflatoksinima. Zemlje sa slabo razvijenim sustavom kontrole hrane trebale bi preko nadležnih tijela povećati učestalost kontrole uzoraka te educirati proizvođače hranjiva za životinje i uzgajivače stoke o potencijalnim štetnim učincima aflatoksina.

Sažetak

Mikotoksin aflatoksin M1 je hepatokarcinogeni metabolit nastao hidroksilacijom aflatoksina B1 u mlijeku krava koje su konzumirale hranu zagađenu aflatoksinom B1. U odnosu na aflatoksina B1, karcinogenost aflatoksina M1 je oko 2-10% izvornog oblika. Izloženost aflatoksinu M1 u ljudi nastaje endogenom proizvodnjom ili unosom mliječnim proizvodima. Kao najveći potrošači mlijeka dojenčad i djeca su najviše izloženi aflatoksinu M1. Aflatoksin M1 je relativno stabilan spoj u sirovom i obrađenom mlijeku te na njegovo prisustvo ne utječe postupak pasterizacije ili prerade u sir. Prijenos aflatoksina od hrane do mlijeka u mliječnih krava je pod utjecajem prehrambenih i fizioloških čimbenika, uključujući i režim hranidbe, stupanj digestije, zdravlje životinja, biotransformacijski kapacitet jetre te proizvodnju mlijeka. Smatra se da proizvodna stada goveda i ovaca koje su na ispaši imaju nizak rizik od kontaminacije. Rizik je u velikoj mjeri vezan na ishranu hranjivima na bazi zrna, posebno silaže od kukuruza i trave koje se daju pri smanjenju ispaše tijekom zimskih mjeseci i u gospodarstvima s intezivnom proizvodnjom mlijeka. Nakon korištenja kontaminirane hrane aflatoksin M1 će se pojaviti u mlijeku dva do tri dana nakon ingestije. U Europskoj Uniji su određene najveće dopuštene količine aflatoksina M1 za sirovo mlijeko, toplinski obrađeno mlijeko i mlijeko za proizvodnju mliječnih proizvoda 0,05 μg/L. Danas se pri određivanju aflatoksina M1 koriste orijentacijske metode među kojima je najzastupljenija ELISA metoda kao brza, jednostavna i pouzdana metoda.
Metode tekućinske kromatografije s masenom spektrometrijom ili visokodjelotvorna kromatografija s flourescentnom detekcijom primijenjuju se kao potvrdne metode.
Proveden je niz studija o pojavi aflatoksina M1 u mlijeku posebice u zadnjem desetljeću.
Koncentracije aflatoksina variraju s obzirom na godišnje doba te su utvrđene povećane koncentracije u vrijeme hladnih mjeseci kada se koriste hranjiva ili koncentrati u hranidbi krava.
Znatno povišene koncentracije aflatoksina M1 u sirovom kravljem mlijeku određene su u Pakistanu, Siriji i Brazilu te u pasteriziranom mlijeku iz Sirije. Niske razine kontaminacije aflatoksinima određene su u europskim zemljama sa stalnim kontrolama proizvodnje hranjiva za životinje te planiranim praćenjem aflatoksina M1 u mlijeku i mliječnim proizvodima.

Literatura [… prikaži]

1. BILANDŽIĆ, N., I. VARENINA and B. SOLOMUN (2010): Aflatoxin M1 in raw milk in Croatia. Food Contr. 21, 1279-1281.
2. BOUDRA, H., J. BARNOUIN, S. DRAGACCI and D. P. MORGAVI (2007): Aflatoxin M1 and ochratoxin A in raw bulk milk from French dairy herds. J. Dairy Sci. 90, 3197–3201.
3. CANO-SANCHO, G., S. MARIN, A. J. RAMOS, J. PERIS-VICENTE and V. SANCHIS (2010): Occurrence of aflatoxin M1 and exposure assessment in Catalonia (Spain). Revista Iberoamericana de Micología 27, 130–135.
4. CAVALIERE, C., P. FOGLIA, C. GUARINO, F. MARZIONI, M. NAZZARI and R. SAMPERI (2006): Aflatoxin M1 determination in cheese by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1135, 135–141.
5. ÇELIK, T. H., B. SARIMEHMETOGLU and Ö. KÜPLÜLÜ (2005): Aflatoxin M1 contamination in pasteurized milk. Vet. Arhiv 75, 57–65.
6. CIEGLER, A., B. LILLEHOJ, R. E. PETERSON and H. H. HALL (1966): Microbial detoxification of aflatoxin. Appl. Microbiol. 14, 934–939.
7. CREPPY, E. E. (2002): Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. Toxicol. Lett. 127, 19–28.
8. DA SILVA, J. B., P. DILKIN, H. FONSECA and B. CORREA (2004): Production of aflatoxins by Aspergillus flavus and of fumonisins by Fusarium species isolated from Brazilian sorghum. Braz. J. Microbiol. 35, 182–186.
9. DUARTE, S. C., A. M. ALMEIDA, A. S. TEIXEIRA, A. L. PEREIRA, A. C. FALCÃO, A. PENA and C. M. LINO (2013): Aflatoxin M1 in marketed milk in Portugal: Assessment of human and animal exposure. Food Contr. 30, 411–417.
10. DURAKOVIĆ, S. i L. DURAKOVIĆ (2003): Mikologija u biotehnologiji, Kugler, Zagreb.
11. EC (2001): Commission Regulation (EC) No 466/2001of 8 March 2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. Off. J. Europ. Comm., L77, 1-13.
12. EC (2003): Commission Directive 2003/100/EC of 31 October 2003 amending Annex I of Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council on undesirable substances in animal feed. Off. J. Europ. Comm., L285, 33-37.
13. EFSA (2004): Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the commission related to aflatoxin B1 as undesirable substance in animal feed. The EFSA Journal 39, 1–27.
14. FALLAH, A. A. (2010): Assessment of aflatoxin M1 contamination in pasteurized and UHT milk marketed in central part of Iran. Food Chem. Toxicol. 48, 988–991.
15. FINK-GREMMELS, J. (2008): Mycotoxins in cattle feeds and carry-over to dairy milk: a review. Food Addit. Contam. A 25, 172–180.
16. GARRIDO, N. S., M. H. IHA, M. R. SANTOS ORTOLANIDUARTE and R. M. FAVARO (2003): Occurrence of aflatoxins M1 and M2 in milk commercialized in Ribeirao Preto-SP, Brazil. Food Addit. Contam. A 20, 70-74.
17. GHANEM, I. and M. ORFI (2009): Aflatoxin M1 in raw, pasteurized and powdered milk available in the Syrian market. Food Contr. 20, 603–605.
18. GHAZANI, M. H. M. (2009): Aflatoxin M1 contamination in pasteurized milk in Tabriz (northwest of Iran). Food Chem. Toxicol. 47, 1624– 1625.
19. GOURAMA, N. and L. B. BULLERMAN (1995): Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus: aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: a review. J. Food Protect. 58, 1395–1404.
20. HESHMATI, A. and J. M. MILANI (2010): Contamination of UHT milk by aflatoxin M1 in Iran. Food Contr. 21, 19-22.
21. HUSSEIN, H. S. and J. M. BRASEL (2001): Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals. Toxicology 167, 101–134.
22. IARC (1993): International Agency for Research on Cancer. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to human. Lyon, France, Vol. 56.
23. IQBAL, S. Z. and M. R. ASI (2013): Assessment of aflatoxin M1 in milk and milk products from Punjab, Pakistan. Food Contr. 30, 235–239.
24. JAY, J. M. (1992): Modern Food Microbiology, 4th ed., Chapman & Hall, New York.
25. KAMKAR, A. (2005): A study on the occurrence of aflatoxin M1 in raw milk produced in Sarab city of Iran. Food Contr. 16, 593–599.
26. KANIOU-GRIGORIADOU, I., A. ELEF HET RIADOU, T. MOURATIDOU and P. KATIKOU (2005): Determination of aflatoxin M1 in ewe ́s milk samples and produced curd and Feta cheese. Food Contr. 16, 257-261.
27. KIM, E. K., D. H. SHON, D. RYU, J. W. PARK, H. J. HWANG and Y. B. KIM (2000): Occurrence of aflatoxin M1 in Korean dairy products determined by ELISA and HPLC. Food Addit. Contam. 17, 59–64.
28. LOPEZ, C., L. RAMOS, S. RAMADAN, L. BULACIO and J. PEREZ (2001): Distribution of aflatoxin M1 in cheese obtained from milk artificially contaminated. Inter. J. Food Microbiol. 64, 211–215.
29. MAURICE, O. M. (2002): Risk assessment for aflatoxins in foodstuffs. Inter. Biodeterion. Biodegrad. 50, 137–142.
30. MUSCARELLA, M., S. LO MAGRO, C. PALERMO and D. CENTONZE (2007): Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk based on immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal. Chim. Acta 594, 257–264.
31. NEMATI, M., M. A. MEHRAN, P. K. HAMED and A. MASOUD (2010): A survey on the occurrence of aflatoxin M1 in milk samples in Ardabil, Iran. Food Contr. 21, 1022–1024.
32. OLIVEIRA, C. A. F. and J. C. O. FERRAZ (2007): Occurrence of aflatoxin M1 in pasteurised, UHT milk and milk powder from goat origin. Food Contr. 18, 375–378.
33. OLIVEIRA, C. P., N. F. F.SOARES, T. V. OLIVEIRA and J. C. B. JÚNIOR (2013): Aflatoxin M1 occurrence in ultra high temperature (UHT) treated fluid milk from Minas Gerais/Brazil. Food Contr. 30, 90–92.
34. OVEISI, M.-R., B. JANNAT, N. SADEGHI, M. HAJIMAHMOODI and A. NIKZAD (2007): Presence of aflatoxin M1 in milk and infant milk products in Tehran, Iran. Food Contr. 18, 1216–1218.
35. PEI, S. C., Y. Y. ZHANG, S. A. EREMIN and W. J. LEE (2009): Detection of aflatoxin M1 in milk products from China by ELISA using monoclonal antibodies. Food Contr. 20, 1080–1085.
36. PIETRI, A., T. BERTUZZI, P. BERTUZZI and G. PIVA (1997): Aflatoxin M1 occurrence in samples of Grana Padano cheese. Food Addit. Contam. 14, 341–344.
37. PITTET, A. (1998): Natural occurrence of mycotoxins in foods and feeds- An updated review. Rev. Med. Vet. 149, 479–492.
38. PRANDINI, A., G. TANSINI, S. SIGOLO, L. FILIPPI, M. LAPORTA and G. PIVA (2009): On the occurrence of aflatoxin M1 in milk and dairy products. Food Chem. Toxicol. 47, 984–991.
39. Pravilnik o najvećim dopuštenim količinama određenih kontaminanata u hrani. Ministarstvo poljoprivrede. Narodne novine 146/2012.
40. Pravilnik o nepoželjnim tvarima u hrani za životinje. Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja. Narodne novine 80/2010.
41. RAHIMI, E., M. BONYADIAN, M. RAFEI and H. R. KAZEMEINI (2010): Occurrence of aflatoxin M1 in raw milk of five dairy species in Ahvaz, Iran. Food Chem. Toxicol. 48, 129–131.
42. RUANGWISES, S. and N. RUANGWISES (2009): Occurrence of aflatoxin M1 in pasteurized milk of the school milk project in Thailand. J. Food Protect. 72, 1761–1763.
43. SANI, A. M., H. NIKPOOYAN and R. MOSHIRI (2010): Aflatoxin M1 contamination and antibiotic residue in milk in Khorasan province, Iran. Food Chem. Toxicol. 48, 2130–2132.
44. SARIMEHMETOGLU, B., O. KUPLULU and T. HALUK CELIK (2004): Detection of aflatoxin M1 in cheese samples by ELISA. Food Contr. 15, 45-49.
45. SHUNDO, L. and M. SABINO (2006): Aflatoxin M1 in milk by immunoaffinity column cleanup with TLC/HPLC determination. Braz. J. Microbiol. 37, 164–167.
46. TAJKARIMI, M., F. ALIABADI-SH, A. SALAH NEJAD, H. POURSOLTANI, A. A. MOTALLEBI and H. MAHDAVI (2008): Aflatoxin M1 contamination in winter and summer milk in 14 states in Iran. Food Contr. 19, 1033-1036.
47. TEKINŞEN, K. K. and H. S. EKEN (2008): Aflatoxin M1 levels in UHT milk and kashar cheese consumed in Turkey. Food Chem. Toxicol. 46, 3287–3289.
48. TURCONI, G., M. GUARCELLO, C. LIVIERI, S. COMIZZOLI, L. MACCARINI, A. M. CASTELLAZZI, A. PIETRI, G. PIVA and C. ROGGI (2004): Evaluation of xenobiotics in human milk and ingestion by the newborn-an epidemiological survey in Lombardy (Northern Italy). Eur. J. Nutr. 43, 191-197.
49. UNUSAN, N. (2006): Occurrence of aflatoxin M1 in UHT milk in Turkey. Food Chem. Toxicol. 44, 1897- 1900.
50. VAN EGMOND, D. H. P., W. E. PAULSCH, H. A. VERINGA and P. L. SCHULLER (1977): The effect of processing on the aflatoxin M1 content of milk and milk products. Archives de l’ Institut Pasteur 3, 381–390.
51. VELDMAN, A., J. A. C. MEIJS, G. J. BORGGREVE and J. J. HEERES-VAN DER TOL (1992): Carry-over of aflatoxin B1 from cow’s food to milk. Anim. Product. 55, 163–168.
52. YANNIKUORIS, A. and J. P. JOUANY (2002): Mycotoxins in feed and their fate in animals: a review. Animal Res. 51, 81–99.

Aflatoxin M1 in milk and milk products

Nina BILANDŽIĆ, PhD, Grad. Biotechnology Eng., Scientific Advisor, Ivana VARENINA, Grad. Biotechnology Eng., Đurđica BOŽIĆ, Grad. Biotechnology Eng., Marija SEDAK, Grad. Food Technology Eng., Maja ĐOKIĆ, Grad. Chem. Technology Eng., Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, Grad. Biotechnology Eng., Željko CVETNIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Associate Proffesor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

Micotoxin aflatoxin M1 hepatocarcinogen metabolite formed by hydroxylation of aflatoxin B1 in the milk of cows fed by feed contaminated with aflatoxin B1. In relation to aflatoxin B1, aflatoxin M1 carcinogenicity is about 2-10% of the original form. Exposure to aflatoxin M1 in humans occurs endogenous production or entering dairy products. As the largest consumers of milk infants and children are most exposed to aflatoxin M1. Aflatoxin M1 is a relatively stable compound in raw and processed milk, and its presence does not affect the process of pasteurization or processing into cheese. Aflatoxin transfer from food to milk in dairy cows is influenced by nutritional and physiological factors, including feeding, degree of digestion, animal health, biotransformation capacity of the liver, and milk production. It is believed that the production of cattle and flocks of sheep that were grazing have a low risk of contamination. The risk is largely related to food nutrients based on grains, especially corn silage and grass that are given to reduce grazing during the winter months and in economies with intensive milk production. After using contaminated food aflatoxin M1 appears in milk two to three days after ingestion. In the European Union, the maximum residue level of aflatoxin M1 in raw milk, heat-treated milk and milk production of dairy products were 0.05 mg/L. Today aflatoxin M1 concentrations in milk and milk products is determining use screening methods among which the most common used is ELISA method, as fast, simple and reliable method. Liquid chromatography with mass spectrometry or high performance chromatography with fluorescent detection applied as a confirmatory method. In the last decade were conducted a number of studies on the occurrence of aflatoxin M1 in milk Aflatoxin M1 concentrations vary according to the season and are set high concentrations in during the cold months when using nutrients and concentrates in the diet of cows. Significantly higher concentrations of aflatoxin M1 in raw cow’s milk were determined in Pakistan, Syria and Brazil, and in pasteurized milk from Syria. Low levels of aflatoxin M1 contamination were determined in certain European countries with permanent controls production of nutrients for animals and the planned monitoring of aflatoxin M1 in milk and milk products.