Panče Dameski, Dražen Vnuk, Boris Habrun* i Gordan Kompes
Mr. Panče DAMESKI, dr. med. vet., Veterinarski Fakultet, Bitola, Makedonija, dr. sc. Dražen VNUK, dr. med. vet., izvanredni profesor, Veterinarski Fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska; dr. sc. Boris HABRUN*, dr. med. vet., izvanredni profesor, (dopisni autor, email: habrun@veinst.hr), dr. sc. Gordan KOMPES, dr. med. vet., viši znanstveni suradnik, Hrvatski Veterinarski Institut, Zagreb, Hrvatska
UvodMaterijali i metodeRezultatiRaspravaZaključakSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
Drugi aspekt ove problematike je moguća infekcija ugriznih rana pasa i mogućnost pravovremene i pravilne uporabe antibiotika na osnovi spoznaja koje su bakterije najučestalije u usnoj šupljini pasa (Goldstein, 1992., Allaker i sur., 1997., Forsblom i sur., 2002.).
Mikroorganizmi izolirani iz inficiranih psećih ugriznih rana slični su onima koji su izolirani iz usne šupljine pasa (Ganiere i sur., 1993.). I u inficiranim i u svježim ugriznim ranama pasa (nije prošlo više od 8 sati od ugriza i rane nisu klinički inficirane) ustanovljeno je da su one polimikrobne sa širokom kombinacijom aerobnih i anaerobnih bakterija (Ordog, 1986., Goldstein, 1999., Talan i sur., 1999.).
Kod izvođenja kirurških zahvata u usnoj šupljini pasa bitno je znati koje bakterije obitavaju u ustima pasa i na osnovi toga napraviti pravilan izbor antiseptika koji će biti najučinkovitiji i koji će u najvećem postotku uspjeti reducirati bakterijsku mikrofloru u ustima (Martin i Nind, 1987., Athanassiadis i sur., 2007.).
Smatra se da preko 80% pasa ima problema s bolestima zuba ili usne šupljine zbog neodgovarajuće higijene i narušene bakterijske mikroflore u ustima (Kyllar i Witter, 2005.). Neugodan zadah iz usta je problem kojeg vlasnici smatraju normalnim te ga ne spominju prilikom odlaska veterinaru. Otežano uzimanje i žvakanje hrane isto tako upućuje i na probleme s usnom šupljinom. Stalne infekcije usne šupljine ne prouzroče samo nemir zahvaćene životinje, već mogu prouzročiti bolesti na udaljenijim organima (De Bowes i sur., 1996.). U Makedoniji dosad nije bilo objavljenih radova na ovu temu i naš je cilj bio uzeti briseve usne šupljine u pasa te izolirati i identificirati bakterije, a onda naše rezultate usporediti s rezultatima drugih istraživanja da bi uvidjeli kako i koliko se podudaraju dobiveni rezultati. Primarna svrha ovog istraživanja bila je ustvrditi glavne vrste aerobnih bakterija prisutnih u usnoj šupljini pasa u Makedoniji.
Materijali i metode
Nakon premedikacije s acepromazinom (Aceprom inj., Innovet, Bukurešt, Rumunjska) u dozi 0,02-0,05 i.m. i intravenske indukcije anestezije s ketaminom (Ketamine 10%, Alfasan, Nizozemska) u dozi 1-4 mg/kg i propofolom (Propofol 1% Fresenius, Fresenius Kabi, Austrija) u dozi 1-5 mg/kg, svaki pas je bio postavljen u sternalni položaj. Brisevi su uzimani s gingive donje čeljusti i dorzalne strane jezika. Gingiva i jezik najprije su bili ispirani dva puta s po 10 mL sterilne fiziološke otopine nakon čega se pristupilo uzimanju briseva.
Ovom prilikom korišteni su komercijalni štapići za uzimanje brisa s transportnom podlogom (Transport swab, Nouva Aptaca, Italija). Prije uzimanja obriska sa životinje, vatu na brisu smo navlaživali s 2-3 kapi sterilne fiziološke otopine. Zatim smo uzimali obrisak tako da je štapić bio prislonjen na mjesto na sluznici s kojeg se uzimao obrisak te je zatim okretan oko svoje osi i na taj način materijal je bio nanešen sa svih strana na vrh štapića. Nakon uzimanja briseva sa sluznica životinje, briseve smo stavljali u epruvete s transportnom podlogom, zatim u hladnjak na +4 °C i unutar 24 h transportirali smo ih u referentni mikrobiološki laboratorij.
Svaki bris je bio nacijepljen na sljedeće hranjive podloge:
- Krvni agar, koji sadrži 5% sterilne defibrinirane ovčje krvi. Ovaj agar služi za izdvajanje i uzgoj raznih zahtjevnih mikroorganizama, posebno patogenih vrsta, kao i za utvrđivanje hemolize.
(Merck 1.10328.0500). Agaru je dodan 1% eskulina radi lakše identifikacije enterokoka. - Hranjivi agar. Ovaj agar je prikladan medij za uzgoj manje zahtjevnih vrsta bakterija. Hranjive tvari iz peptona, mesnog ekstrakta i vitamini iz ekstrakta kvasaca pogoduju rastu većine bakterija. (Bio-Rad 356 4484, dehidriran 500 g)
- Xylose – Lysine – Desoxycholate agar, (XLD). Ovo je selektivni agar za izdvajanje bakterija porodice Enterobacteriae (Bio-Rad 356 9124).
Sve agare smo inkubirali u aerobnim uvjetima, na temperaturi 37 °C. Agare smo pregledavali nakon 24 i 48 sati inkubacije.
Identifikacija bakterija rađena je s komercijalnom biokemijskom galerijom BBL CRYSTAL (Identification Systems, Becton Dickinson, SAD).
Rezultati
Od 40 uzetih briseva izolirano je bilo 24 rodova i vrsta. Od bakterija koje smo izolirali najčešća je bila Enterococcus sp. koja je izolirana u 19 od ukupno 40 briseva ili u 47,5% briseva.
Druge najučestalije izolirane bakterije su bile: Staphylococcus aureus u 18 briseva ili 45,0%, Escherichia coli u 16 briseva ili 40,0%, Pasteurella multocida u 13 briseva ili 32,5%, β hemolitički Streptococcus sp. u 12 briseva ili 30,0%, Neisseria sp. u 5 briseva ili 12,5%.
Još su pojedinačno bili izolirani: Pasteurella canis (5,0%), Proteus sp. (5,0%), Bacillus cereus (5,0%), Micrococcus sp. (5,0%), Streptococcus sp. (5,0%), Enterococcus faecium (5,0%), Corynebacterium renale (2,5%), Streptococcus faecalis (2,5%), Klebsiella oxyctoca (2,5%), Kingella denitrificans (2,5%), Proteus mirabilis (2,5%), Streptococcus pyogenes (2,5%), Sphingomonas paucimobilis (2,5%), Erysipelotrix rhusiopathie (2,5%), Streptococcus sp. (2,5%), Klebsiella sp. (2,5%), Enterobacter cloacae complex (2,5%), Acinetobacter sp. (2,5%), Leuconostoc sp. (2,5%).
Rasprava
Kasempimolporn i sur. (2003.) ispitivali su aerobnu bakterijsku mikrofloru u ustima pasa. Oni su uzeli briseve od 21 psa s bukalne sluznice, od kojih je 5 bilo zaraženih s virusom bjesnoće i ukupno su izolirali 20 vrsta bakterija.
Najučestalije izolirane bakterije su bile Klebsiella pneumoniae spp. pneumonia, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Acinetobacter calcoaceticus i Pasteurella sp. Nije bilo razlike u aerobnoj bakterijskoj flori između zdravih pasa i pasa oboljelih od bjesnoće.
Talan i sur. (1999.) ispitivali su bakterijsku mikrofl oru u 50 inficiranih psećih ugriznih rana u ljudi. Najčešće izolirane aerobne bakterije bile su: Pasteurella (50%), Streptococcus (46%), Staphylococcus (46%), Neisseria (32%) i Corinebacterium (12%). Ostale izolirane aerobne bakterije prema učestalosti su bile Moraxella (10%), Enterococcus (10%), Bacillus (8%), Pseudomonas (6%), Actinomyces (6%), Brevibacterium (6%), Escherichia coli (6%), Klebsiella (4%), Lactobacillus (4%), Citrobacter (4%), Flavobacterium (4%), Micrococcus (4%), Proteus mirabilis (4%), Capnocytophaga ochracea (2%), Eikenella corrodens (2%), Flavimonas oryzihabitans (2%), Stomatococcus mucilaginosus (2%).
Radice i sur. (2006.) ispitivali su subgingivalnu bakterijsku mikrofloru u 13 pasa koji su imali periodontalne bolesti. U istom istraživanju ispitivali su još i osjetljivost izoliranih bakterija na određene antibiotike. Autori su u svom radu od aerobnih bakterija najčešće uspjeli izolirati α-hemolitički Streptococcus, a dosta često uz njega su i Escherichia coli, Pasteurella multocida i Streptococcus intermedius.
Naše istraživanje je provedeno s ciljem utvrđivanja aerobne bakterijske mikroflore u ustima klinički zdravih pasa u Makedoniji. Od aerobnih bakterija najčešće izolirani su bili Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pasteurella multocida, β hemolitički Streptococcus sp., i Neisseria sp. Ovi se rezultati u određenoj mjeri podudaraju s rezultatima drugih sličnih istraživanja.
Najčešće izolirana bakterijska vrsta u našem istraživanju bila je Enterococcus sp. (47,5%). Enterokoki su bakterije koje se nalaze u velikom broju staništa, u probavnom traktu sisavaca, tlu, vodi, biljkama, kukcima i prehrambenim proizvodima (Witte i sur., 1999., Giraffa, 2000.). Oni su i jedni od najčešćih uzročnika bolničkih infekcija, jer su otporniji od ostalih bakterija na antimikrobne lijekove, koji se obično koriste u humanoj i veterinarskoj medicini (Martone, 1998., Cetinkaya i sur., 2000.). Osim što su poznati kao jedan od glavnih uzročnika bolničkih infekcija, enterokoki su i rezervoar antimikrobnih gena otpornosti (Landman i Quale, 1997., Klare i sur., 2001.). Opasnost od neizlječivih enterokoknih infekcija je postojana i velika zbog porasta antimikrobne rezistencije ovih bakterija, uključujući tu i otpornost na više lijekova (engl. multi-drug resistance – MDR). Mogući prijenos otpornosti na više lijekova (MDR) između bakterija još više kompliciraju ovaj problem (Murray, 1998., Simjee i sur., 2002., Guardabassi i sur., 2004., Leener i sur., 2005.). Farmske životinje su mnogo više u fokusu proučavanja načina prijenosa rezistentnih patogenih bakterija i komenzala na ljude.
Mnogo manja pozornost je usmjerena na kućne ljubimce i njihovu ulogu u širenju rezistentnih patogenih bakterija na ljude (Guardabassi i sur., 2004.). Psi i mačke su rezervoar i izvor enterokoka i mogu biti prenositelji ove bakterije na ljude zbog bliskog fizičkog kontakta ljudi i njihovih kućnih ljubimaca. Široka primjena antimikrobnih lijekova u ovih životinja povećava vjerojatnost nastanka rezistencije u ovih bakterija (Van Belkum i sur., 1996., De Graef i sur., 2004., Guardabassi i sur., 2004., Leener i sur., 2005.).
Jackson i sur. (2009.) su u svom istraživanju izolirali enterokoke s različitih dijelova tijela s pasa i mačaka.
Broj izoliranih enterokoka je bio manji s područja zuba i nosa u usporedbi s brojem izoliranih enterokoka s područja rektuma, abdomena i stražnjih nogu.
Njihovi rezultati pokazuju da različiti dijelovi tijela pasa i mačaka mogu biti kontaminirani s enterokokima. To je osobito važno s obzirom da kućni ljubimci imaju bliske kontakte sa svojim vlasnicima i da je rizik direktnog prijenosa ove bakterija velik. Osim toga psi i mačke mogu kontaminirati okolinu s ovom bakterijom i postoji mogućnost da se ona prenese na ljudima i neizravnim kontaktom (Jackson i sur., 2009.).
U pogledu vrste Staphylococcus aureus kao jedne od najčešće izoliranih bakterija u našem istraživanju (izolirana je u 45,0% uzetih briseva), interesantno je spomenuti da se dobiveni rezultati u velikoj mjeri poklapaju s opažanjima Danielsa (1986.) i Kizera (1978.) koji su u svojim radovima ustanovili da se Staphylococcus aureus učestalije izolira iz životinja koje su sklone ugrizima i da se češće izolirao iz muških životinja, iz većih i radnih pasmina nego Staphylococcus intermedius. Dalje, Staphylococcus aureus znatno češće je bio izoliran iz pasa koje se čuvaju na otvorenom u boksovima nego kod onih koji žive u kućama. Ova se pojava, prema Danielsu (1986.) i Kizeru (1978.) može djelomično objasniti većom izloženošću ovih pasa drugim životinjama i ljudima što povećava stopu izoliranosti vrste Staphylococcus aureus među psima i mačkama.
U našem radu učestalo je izolirana Pasteurella multocida, a nešto rijeđe Pasteurella canis. Zajedno su ove bakterije izolirane u 37,5% ispitanih uzoraka. Ovi rezultati su slični s drugim istraživanjima gdje je Pasteurella sp. izolirana iz usta pasa od 12,5% do 87% (Bailie i sur., 1978., Ganiere i sur., 1993.). Smatra se da je ova bakterija najveći patogen u inficiranim ugriznim ranama i da infekcija rana pasterelom nastaje mnogo brže.
Rezultati iz literature u određenoj su mjeri slični rezultatima koje smo dobili u našem istraživanju. Razlike koje postoje u pogledu vrste izoliranih bakterija i njihova učestalost ovise o više pokazatelja i mogu biti rezultat različitih populacija pasa, različitog načina držanja životinja i različitog načina hranidbe.
Starost pasa igra veliku ulogu u pogledu sastava bakterijske mikroflore usne šupljine. Tako mlađi psi u pravilu imaju siromašniju bakterijsku mikrofloru od starijih životinja, a veće pasmine pasa u pravilu imaju manje problema s bolestima usne šupljine nego manje pasmine. Ovo se osobito odnosi na male, brahiocefalične pasmine pasa (Harvey i sur., 1994.). Hranidba je isto tako jako bitna, hrane li se psi suhom dehidriranom hranom ili kuhanom tekućom (Genco i sur., 1998., Gorrel, 1998., Harvey, 1998., Lund i sur., 1999.). Tako su psi koji su se hranili s dehidriranom granuliranom hranom imali znatno manje plaka i zubnog kamenca i razvili su manje upale gingiva nego psi koji su bili hranjeni kuhanom tekućom hranom. Još je uočeno da je bila bitna oralna higijena, (redovita, povremena ili uopće je nema). Nedostatak oralne higijene prouzroči povećanje broja bakterija i bogatiju bakterijsku mikrofloru što prouzroči taloženje plaka i nastanak zubnog kamenca s posljedičnom upalom gingiva (Lindhe i sur., 1975., Page i Shroeder, 1982.). Sve su to čimbenici koji bitno utječu na sastav oralne aerobne bakterijske mikroflore u pasa i na učestalost patoloških stanja u usnoj šupljini psa i na zdravlje pasa.
Zaključak
Razumijevanje sastava bakterijske mikroflore je jako bitno, jer se tako mogu prevenirati patološka stanja usta. Iz velikog broja istraživanja na ljudima, može se zaključiti se da je najbolja prevencija bolesti usta, redovita svakodnevna oralna higijena. Kliničari poznavanjem bakterijske mikroflore usne šupljine mogu poboljšati učinkovitost liječenja bolesti usta u pasa, a vlasnici uz odgovarajuću dentalnu higijenu mogu u velikom postotku sniziti učestalost bolesti usta u svojih ljubimaca.
Sažetak
B olesti usta su česte u pasa i mogu prouzročiti različita patološka stanja i čak dovesti do gubitka zuba. Iz više opsežnih istraživanja na ljudima, postalo je jasno da je razumijevanje mikrobne ekologije usta temeljno za rasvjetljavanje etiologije većine oralnih bolesti.
Mikrobna ekologija usta pasa relativno je slabo istraživana i uglavnom se radilo o istraživanjima koja su ispitivala bakterije u ugriznim ranama pasa. Poznavanje sastava bakterija u ustima pasa je bitan iz aspekta prevencije nekih bolesti, kao što su paradontoza, zubni kamenac, karijes. Cilj ovog istraživanja bilo je ispitati koje su bakterije najzastupljenije u usnoj šupljini pasa u Republici Makedoniji, koje se mogu uzgajati in vitro u cilju pružanja osnovnih informacija za unapređenje zdravstvene oralne skrbi pasa. Od 20 pasa uziman je po jedan bris s dorzalne strane jezika i jedan bris s gingive donje vilice, uzeto je ukupno 40 briseva. Izolirano je 24 vrste aerobnih bakterija, a najučestalije izolirane aerobne bakterije bile su: Enterococcus sp. (47,50%), Staphylococcus aureus (45,00%), Escherichia coli (40,00%), Pasteurella multocida (32,50%), β hemolitički Streptococcus sp. (30,00%), Neisseria sp. (12,50%).
Ključne riječi: bakterijska mikroflora, aerobi, usna šupljina, pas
Literatura [… prikaži]
Bacterial Microflora in the Mouth of Dogs in Macedonia
Panche DAMESKI, DVM, Faculty of Veterinary Medicine, Bitola, Macedonia; Dražen VNUK, DVM, PhD, Associate Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia; Boris HABRUN, DVM, PhD, Associate Professor, Gordan KOMPES, DVM, PhD, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia
O ral diseases are frequent in dogs and can cause various pathological conditions and often lead to tooth loss. From a wide range of human studies, it has become clear that understanding the microbial ecology of the mouth is the key to discovering the etiology of most oral diseases. The microbial ecology of the mouth of dogs is relatively poorly investigated and most studies have investigated bacteria from dog bite wounds.Knowing the consistency of the bacteria in the mouths of dogs is important for the prevention of certain diseases, such as paradontosis, tartar, and caries. The objective of this study was to determine the most common bacteria in the mouths of dogs in the Republic of Macedonia that could be isolated in vitro in order to gather basic information for improvement of the oral health of dogs.
Samples were taken from 20 dogs from the dorsal side of the tongue, and another sample from the gingiva of the lower jaw for a total of 40 samples. 24 aerobic bacteria species were isolated, and the most common aerobic bacteria were: Enterococcus sp. (47.50%), Staphylococcus aureus (45.00%), Escherichia coli (40.00%), Pasteurella multocida (32.50%), β hemolytic Streptococcus sp. (30.00%), and Neisseria sp. (12.50%).
Key words: Bacterial microfl ora, Aerobic, Oral cavity, Dog