Marija Denžić i Nina Bilandžić
Marija DENŽIĆ, dip. ing. kemije, Laboratorij za analitičku kemiju i rezidue, Veterinarski zavod Križevci, Križevci; dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica; Laboratorij za određivanje rezidua, Odjel za veterinarsko javno zdravstvo, Hrvatski veterinarski institut Zagreb
Uvod
B enzimidazoli su veterinarski lijekovi široko upotrebljavani kod prevencije i tretiranja parazitskih infekcija u agrikulturi i akvakulturi. Neki su benzimidazoli pronašli primjenu kao fungicidi sa širokim spektrom djelovanja na gljivice koje napadaju usjeve, skladišteno voće i povrće. Prvi korišteni benzimidazol bio je tiabendazol prije više od 40 godina koji se koristio za kontrolu gastrointestinalnih nematoda, plućnih nametnika te kao fungicid.
Benzimidazoli sa sulfidnom i sulfoksidnom funkcionalnom grupom postupno su uvođeni na tržište nudeći širi spektar djelovanja i poboljšanu učinkovitost. Albendazol, fenbendazol i oksfendazol bili su prvi takvi benzimidazoli koji su uspješno korišteni u liječenju svih razvojnih stadija gastrointestinalnih nematoda.
Benzimidazol triklabendazol je kasnije uveden na tržište za liječenje svih stadija jetrenih metilja, ali se pokazao neučinkovitim kod liječenja nematoda.
Slaba topljivost benzimidazola sa sulfidnom i sulfoksidnom grupom vodi ka slaboj apsorpciji iz crijeva, što rezultira niskom biološkom dostupnošću.
Netobimin i febantel, koji su ishodni lijekovi albendazola i febendazola, imaju veću topljivost u vodi pa prema tome i povećanu apsorpciju i povećanu biološku dostupnost.
Kako bi se osigurala sigurnost hrane, a time i zdravlje ljudi, u Europskoj uniji pa tako i u Hrvatskoj, doneseni su propisi o farmakološkim djelatnim tvarima, uključujući i antiparazitske lijekove iz skupine benzimidazola, i njihovoj klasifikaciji u odnosu na najveće dopuštene količine ostataka u hrani životinjskog podrijetla (EC, 2010.).
U ovom su radu prikazani literaturni podatci o ostatcima benzimidazola u hrani životinjskog podrijetla.
Rad obuhvaća prikaz djelovanja antiparazitskih benzimidazolnih lijekova na različite životinjske vrste, metabolizam unesenih lijekova te metode određivanja ostataka.
Sudbina benzimidazolnih lijekova u organizmu životinja
Metabolizam benzimidazola
U živim organizmima lijekovi se metaboliziraju kroz metabolitički put jedne od dviju faza (faze I ili faze II) (Horvat i sur., 2012.). Metabolitički put faze I uključuje oksidaciju, redukciju ili hidrolizu, a metaboliti su obično znatno reaktivniji i toksičniji nego polazni lijek.
Metabolitički put faze II obično uključuje nastajanje neaktivnih spojeva.
Polazni lijekovi febantel i netobimin transformiraju se u benzimidazolne spojeve fenbendazol i albendazol (Slika 1). Albendazol i fenbendazol posjeduju sulfidnu funkcionalnu grupu koja je podložna oksidaciji, a rezultat toga je oksidacija albendazola u albendazol sulfoksid, glavni aktivni metabolit koji se djelomično oksidira u albendazol sulfon.
Primarni metabolit albendazol sulfoksid posjeduje antihelmitičnu aktivnost te je djelotvornost albendazola pripisana upravo tom metabolitu. Albendazol sulfoksid je topljiviji i efikasniji u odnosu na polaznu supstanciju. Fenbendazol oksidira u aktivni fenbendazol sulfoksid poznatiji kao oksfendazol. Navedeni sulfoksidi sadrže u svojoj kemijskoj strukturi asimetrični centar zbog kojeg su identificirane dvije enantiomerne forme.
Triklabendazol isto tako sadrži sulfidnu grupu na položaju 2 benzimidazolnog bicikličkog sistema i pokazuje ista svojstva.
Mebendazol i flubendazol posjeduju keto-grupu koja se može reducirati u hidroksilnu grupu. Farmakokinetičke studije koje su obuhvatile istraživanje stereospecifičnosti enzimske redukcije karbonilne skupine flubendazola in vivo i in vitro pokazale su da glavni metabolit je (+)-reducirani flubendazol. Albendazol, fenbendazol, mebendazol i flubendazol posjeduju karbamatnu grupu koja se može hidrolizirati u aminobenzimidazol.
Tiabendazol može oksidirati uz nastajanje 5-OH-tiabendazol.
Triklabendazol oksidira uz nastajanje sulfoksidnih i sulfonskih metabolita, triklabendazol sulfoksida i triklabendazol sulfona (Slika 2). Hidroksilacijom triklabendazola na položaju 4 diklorfenoksi prstena nastaju odgovarajući hidroksilirani metaboliti: hidroksi- triklabendazol, hidroksi- triklabendazol sulfoksid i hidroksi- triklabendazol sulfon (Mottier i sur., 2004.). 4-Hidroksi-metabolit i keto-metabolit triklabendazola pronađeni su kod štakora, koza i ovaca.
Vrlo je malo podataka objavljeno o metabolitima oksibendazola. U urinu i tkivima identificirana su dva metabolita: 5-OH-oksibendazol i 6-OH-oksibendazol.
Međutim, ti metaboliti čine samo 15 do 20% ukupnih ekstrahiranih ostataka, dok ostali nisu identificirani.
Metaboličkom razgradnjom benzimidazolnih lijekova u organizmu životinja nastaje jedan glavni metabolit ili više glavnih metabolita pojedinog lijeka, koji su identificirani u životinjskom tkivu ili mlijeku. Pronađeni metaboliti ovise o: strukturi polazne supstancije, tkivu i životinjskoj vrsti.
Zbog svoje kemijske strukture, svi benzimidazolni lijekovi osjetljivi su na svjetlo. Glavni produkti fotorazgradnje su aminski derivati nastali demetilacijom esterske grupe i dekarboksilacijom karbamatne grupe kao što je prikazano na slici 3.
Jacob i suradnici (1975.) istraživali su fotorazgradnju tiabendazola obilježenog izotopom ugljika 14C. Prilikom izlaganja tiabendazola sunčevoj svjetlosti uz polazni spoj pronađena su i dva razgradna produkta: benzimidazol i benzimidazol-2-karboksamid.
Distribucija benzimidazola u životinjskim tkivima
Albendazol, albendazol sulfoksid i netobimin
Albendazol je benzimidazolni karbamat koji se koristi za liječenje gastrointestinalnih infekcija s glistama, trakavicama, plućnim nametnicima i odraslim metiljima Fasciola hepatica (EMEA, 2004.a). Zbog njegove slabe biodostupnosti terapeutska učinkovitost u liječenju ehinokoka je nepredvidiva.
Albendazol djeluje jakim vezanjem na tubulinske stanice nematoda. Pri tom su posebno pogođene intestinalne stanice nematoda što rezultira slabljenjem apsorptivne funkcije i prouzroči izgladnjivanje nematoda do smrti.
Kod preživača se oralno dana doza albendazola trenutno apsorbira iz crijeva, pri čemu stoka apsorbira oko 50% oralne doze. Nakon oralnog uzimanja, albendazol se vrlo brzo metabolizira oksidacijom sulfidne grupe u sulfoksid i sulfon te deacetilacijom karbamatne grupe i nastajanjem 2-aminosulfona.
Aktivni nastali metabolit albendazol sulfoksid smjesa je R(+) i S(-) enantiomera.
Kod životinja je nastajanje R(+) albendazol sulfoksida katalizirano mikrosomskom flavin monooksidazom, dok je nastajanje S(-) albendazol sulfoksida katalizirano enzimskim sustavom citokrom P450 (Kitzman i sur., 2002.).
Kod stoke tretirane radioaktivno obilježenim albendazolom, većina ostataka detektirana je u jetri, a manjim dijelom u bubrezima. Kod stoke liječene sa 14C obilježenim albendazolom u dozi od 15 mg/kg, ukupni ostatci u jetri varirali su od više od 20 mg/kg jedan dan nakon liječenja do 6 mg/kg 4 dana nakon liječenja te oko 1,2 mg/kg 20 dana nakon liječenja (EMEA, 2004.a). Kod teladi, 90% ostataka ekstrahirano je iz jetre jedan dan nakon tretiranja s radioaktivno obilježenim albendazolom. Međutim, 4 do 10 dana nakon tretiranja pronađeno je samo 20 do 30% ostataka. Od ukupne količine ekstrahiranih ostataka jedan dan nakon tretiranja, 27% se odnosilo na polazni lijek, a 52% na njegove metabolite (sulfoksid, sulfon i amino-sulfon). Četiri dana nakon liječenja albendazolom nije pronađen u tkivima, a njegovi metaboliti činili su 40 do 50% količine ekstrahiranih rezidua. Kod ovaca tretiranih oralno s albendazolom, 100% ostataka ekstrahirano je iz jetre jedan dan nakon tretiranja. Četiri dana nakon tretiranja ekstrahirano je 37% ostataka, dok je 8 dana nakon tretiranja pronađeno samo 13% ostataka. Studije o razgradnji albendazola u pastrvi, tilapiji i lososu pokazale su da su 120 sati nakon tretiranja albendazol sulfoksid i albendazol amino-sulfon glavni metaboliti pronađeni u mišićima i kožnom tkivu pastrve i tilapije, dok su kod lososa glavni ostatci bili albendazol i albendazol sulfoksid.
Lijek albendazol sulfoksid dostupan je u obliku tekućine za oralnu uporabu.
Preporučeno doziranje je 7,5 mg/kg do 10 mg/kg tjelesne mase u mjesečnim razmacima (EMEA, 1996.).
Albendazol sulfoksid isto tako djeluje jakim vezanjem na tubulinske stanice.
Farmakokinetičke studije pokazale su da se sporo metabolizira u ostale metabolite hidroksilacijom, oksidacijom u sulfon, deacetilacijom u amin i redukcijom u albendazol. Kod ovaca tretiranih oralno s albendazol sulfoksidom nakon jednog dana kao glavni metabolit u jetrima i bubrezima pronađen je albendazol sulfon.
Isto su tako netobiminski lijekovi dostupni kao tekućina za oralnu primjenu. Preporučena doza za liječenje gastrointestinalnih infekcija glistama i trakavicama je 7,5 mg/kg tjelesne mase, dok se kod liječenja osteratagiaze tipa 2 i odraslih metilja preporučuje doza od 20 mg/kg tjelesne mase (EMEA, 1999.). Kako bi bio farmakološki aktivan, netobimin se mora konvertirati u lijek albendazol što se događa prirodnim putem u crijevima preživača.
Kod teladi i ovaca tretiranih oralno s netobiminom kao glavni metabolit 18 sati nakon tretiranja pronađen je albendazol.
Albendazol sulfoksid i albendazol amino-sulfon pronađeni su kao glavni metaboliti 3 dana poslije tretiranja.
Febantel, fenbendazol i oksfendazol
Febantel je predlijek, koji se in vivo metabolizira u benzimidazolni antihelmintik fenbendazol (EMEA, 2003.). Febantel se koristi za liječenje i kontrolu gastrointestinalnih glista, plućnih nametnika i trakavica. Polazni se lijek fenbendazol sulfid vrlo lako oksidira u sulfoksidni metabolit oksfendazol, koji je isto tako vrlo važan antihelmintik. Sulfoksid se dalje može oksidirati u sulfon, manje aktivan metabolit. Osim njega kao produkt oksidacije na položaju 4 fenolnog prstena nastaje p-hidroksifenbendazol za kojeg se smatra da isto tako posjeduje slabu antihelmintičnu aktivnost. Svi se navedeni lijekovi koriste kod liječenja stoke, koza, ovaca, konja i svinja.
Studije su na životinjama pokazale su da nakon tretiranja s febantelom, fenbendazolom i oksfendazolom najzastupljeniji ostatci bili fenbendazol, oksfendazol i fenbendazol sulfon (Danaher i sur., 2007.). Slično kao i kod albendazola, fenbendazola i odgovarajući ostatci lijeka većinom su pronađeni u jetri i bubrezima, uz manju količinu pronađenu u mišićima i masnom tkivu.
Kod stoke liječene oralno febantelom, 90% ostataka ekstrahirano je iz jetre 18 sati nakon liječenja. Od ukupnih ekstrahiranih ostataka, fenbendazol čini 30 do 41%, oksfendazol 4 do 19%, fenbendazol sulfon 14 do 15% te febantel 3 do 6%. Deset dana nakon liječenja, iz jetre je ekstrahirano manje od 25% ostataka, pri čemu je kao najzastupljeniji metabolit pronađen fenbendazol amino-sulfon u udjelu od 12 do 35% od ukupnih ekstrahiranih ostataka.
Mebendazol
Mebendazol je benzimidazolni antihelmintik koji se koristi oralno kod konja u dozi od 8,8 mg/kg tjelesne mase, a kod ovaca i koza u dozi od 15 mg kg-tjelesne mase (EMEA, 2001.).
Osim toga koristi se kod jegulja za liječenje infekcija s Pseudodactylogyrus spp. Njegovo se djelovanje temelji na ometanju metabolizma ugljikohidrata i sprječavanju polimerizacije mikrotubula.
Ketoredukcijom mebendazola nastaje metil[5-(1-hidroksi-1-fenil)metil-1H-benzimidazol-2-il] karbamat (MBZ-OH), dok hidrolizom karbamata nastaje 2-amino-1H-benzimidazol-5-il) fenilmetanon (MBZ-NH2).
Kod ovaca oralno tretiranih me bendazolom jedan dan nakon tretiranja iz jetre, mišića, bubrega i masnog tkiva ekstrahirano je redom 26%, 5%, 8% i 2% ostataka. Sedam i 14 dana nakon tretiranja iz jetre je ekstrahirano 87% ostataka, a iz bubrega 74 do 78% ostataka u odnosu na ukupne ekstrahirane ostatke iz pojedinih vrsta tkiva. Dan nakon tretiranja udjel polaznog lijeka u jetrima, mišićima, bubrezima i masti bio je 8%, 3%, 20% i 30% od ukupnih ekstrahiranih ostataka, dok je udjel MBZ-OH bio 47%, 90%, 14% i 67% od ukupnih ekstrahiranih ostataka iz pojedinih vrsta tkiva. Tri dana nakon tretiranja MBZ i MBZ-OH pronađeni su u udjelu od 2% i 3,5% od ukupne količine ekstrahiranih ostataka. Zastupljenost MBZ i njegovih metabolita kod koza bila je slična kao kod ovaca. Kod konja je kao najzastupljeniji metabolit pronađen MBZ-NH2, dok su MBZ i MBZ-OH pronađeni u znatno manjim količinama. Najveća količina ostataka pronađena je u jetrima i bubrezima, a manji udjeli pronađeni su u mišićima i masti (EMEA, 2001.).
Flubendazol
Flubendazol je fluorov analog mebendazola i stoga ima slična svojstva kao mebendazol. Prikladan je za oralnu primjenu kod svinja, kokošiju i ptica za ulov (EMEA, 2006.a).
Kod svinja tretiranih s flubendazolom šest sati nakon uzimanja lijeka je 29%, 20%, 10% i 11% ostataka ekstrahirano redom iz jetre, bubrega, mišića i masnog tkiva u odnosu na ukupne ekstrahirane ostatke. Pet do 30 dana nakon tretiranja približno 50% ostataka ekstrahirano je iz jetre i bubrega. Šest sati nakon tretiranja najzastupljeniji ostatak bio je hidrolizirani metabolit flubendazola s udjelom u jetri, bubrezima, mišiću i masnom tkivu od redom 47%, 94%, 94% i 31% u odnosu na ukupno ekstrahirane ostatke iz pojednih vrsta tkiva. Deset dana nakon tretiranja hidrolizirani metabolit flubendazola pronađen je u udjelu od 18% i 23% u jetri i bubrezima.
Glavni metaboliti flubendazola su hidrolizirani metabolit flubendazola i reducirani metabolit flubendazola. De Ruyck i suradnici su istraživali sudbinu ostataka flubendazola kod purana (De Ruyck i sur., 2001.). Pronašli su da je najzastupljeniji hidrolizirani metabolit flubendazola u prsnom mišiću purana.
Tiabendazol
Antihelmintik tiabendazol posjeduje fungicidna svojstva.
Pokazao se djelotvornim za suzbijanje različitih gljivica koje uzrokuju bolesti kod biljaka, životinja, ali i ljudi te određenih sojeva gljivica koje proizvode mikotoksine.
Tiabendazol je slabo djelotvoran protiv bakterija, aktinomikoza i kvasaca.
Djelotvoran je pri suzbijanju patogenih gljivica uključujući dermatofite Microsporum i Trichophyton te gljivica vrste Cladosporium, Phialosphora, Fonsecaea, Madurella, Pyrenochacta, Leptoshaera i Hormodendrum (Jacob i sur., 1975.).
Kod teladi tretirane oralno tiabendazolom, njegovi su ostatci pronađeni većinom u jetri i bubrezima (EMEA, 2004.b). Jedan dan nakon tretiranja, ostatci tiabendazola su nađeni pretežito u bubrezima, dok je njihov udjel u jetri bio manji. U periodu dužem od dva dana, ostatci su većinom nađeni u jetri. Najzastupljeniji metabolit u tkivu jedan dan nakon tretiranja bio je tiabendazol uz prisutnost manjih količina 5-OH-tiabendazola.
Istraživanja su isto tako pokazala da je kod nesilica jedan dan nakon tretiranja tiabendazolom najzastupljeniji metabolit 5-OH-tiabendazola, dok su udjeli tiabendazola bili manji. Ovce oralno tretirane tiabendazolom žrtvovane su sedmi i deseti dan nakon tretiranja. Kao jedini metabolit pronađen je tiabendazol.
Kod svinja tretiranih oralno nakon 7 i 10 dana nisu pronađeni nikakvi ostatci tiabendazola. Kod stoke tretirane oralno, tiabendazol je pronađen kao glavni metabolit uz manje udjele 5-OH-tiabendazola.
Triklabendazol
Triklabendazol je benzimidazolni antihelmintik široko upotrebljavan za liječenje jetrenog metilja, Fasciola hepatica, kod ovaca i koza (EMEA, 2006.b).
Primjenjuje se oralno u dozi od 10 mg/kg tjelesne mase kod ovaca, odnosno 12 mg/kg tjelesne mase kod koza i to 8 do 10 tjedana tijekom zaraze metiljima ili 5 do 6 tjedana tijekom akutne ili subakutne faze.
Kod stoke i ovaca tretiranih oralno triklabendazolom su kratko nakon prestanka liječenja (2 dana) ostatci triklabendazola nađeni u vrlo visokim udjelima u jetri i bubrezima te u manjim udjelima u mišiću i masnom tkivu.
Nakon dužeg razdoblja (više od 28 dana) udjeli ostataka triklabendazola u mišiću, jetri i bubrezima bili su podjednaki.
Doprinos pojedinih metabolita ukupnim metabolitima triklabendazola u životinjskim tkivima nije objavljen.
Oksibendazol
Oksibendazol je benzimidazolni lijek širokog spektra djelovanja koji se koristi za liječenje odraslih i ličinka intestinalnih nematoda kod prasadi (EMEA, 1997.).
Daje se oralno u preporučenoj dozi od 15 mg/kg tjelesne mase ili u hrani u dozi od 40 mg/kg hrane kroz 10 dana ili 2 mg/kg tjelesne mase po danu.
Djeluje narušavanjem nastajanja ATP-a i nepovratnim inhibiranjem glukoze u parazitskim crvima što rezultira njihovim polaganim odumiranjem.
Vrlo je malo objavljenih podataka o metabolizmu oksibendazola. Međutim, studije provedene na svinjama pokazuju da se lijek izrazito metabolizira u jetri (Gottschall i Wang, 1996.). Svinje su zaklane 10 sati, 24 sata i 7 dana nakon oralne primjene 14C-oksibendazola u dozi od 15 mg/kg tjelesne mase. Maseni udjeli ukupnih ostataka oksibendazola u jetri bili su najviši 24 sata nakon primanja lijeka (4 mg/kg), a 7 dana nakon primjene lijeka smanjili su se na 1,8 mg/kg.
Zbog učestale i često pogrešne primjene antihelmintičnih lijekova širokog spektra djelovanja pojavljuje se rezistentnost helminta na navedene lijekove koja je sve više rasprostranjena u mnogim dijelovima Europe. Posljedica toga je postojanje nekoliko višestruko rezistentnih sojeva (Papadopoulos i sur., 2012.). Zbog pojave rezistentnosti helminta na benzimidazolne lijekove potrebno je prilikom liječenja kombinirati kemijske, ekološke i imunološke potrebe u svrhu kvalitetnog liječenja.
Kontrola benzimidazola u hrani životinjskog podrijetla
U životinjskom tkivu može se pronaći velik broj različitih ostataka benzimidazola te se zbog štetnih utjecaja koje te tvari mogu imati na zdravlje ljudi provodi kontrola njihove primjene.
U Europskoj uniji kontrola ostataka veterinarskih lijekova provodi se u skladu sa zahtjevima Uredbom Komisije 96/23/EC (EC, 1996.) i Odluci Komisije 97/747/EC (EC, 1997.). Najviše dopuštene količine određene su Uredbom Komisije 37/2010. o farmakološki djelatnim tvarima i njihovoj klasifikaciji u odnosu na najveće dopuštene količine rezidua farmakološki djelatnih tvari u hrani životinjskog podrijetla (EC, 2010.).
Neočekivani benzimidazolni ostatci mogu se pojaviti u tkivima zbog pogrešnog liječenja životinjske vrste, zbog prevelike količine unesenog lijeka u odnosu na preporučenu dozu, zbog nepoštivanja karence ili zbog toga što je životinja konzumirala kontaminiranu hranu.
Za većinu benzimidazola, markerski ostatak u tkivu definiran je kao suma udjela polaznog lijeka i/ili njegovih najzastupljenijih ili najotpornijih metabolita.
Nakon uzimanja albendazolnih lijekova, pronađeni ostatci ovise o korištenom lijeku (albendazol, albendazol sulfoksid ili netobimin), načinu uzimanja lijeka, analiziranom tkivu i vremenu koje je prošlo nakon uzimanja lijeka.
Kratko vrijeme nakon prestanka uzimanja npr. albendazolnih lijekova kao najzastupljeniji metaboliti mogu se pronaći albendazol sulfoksid i albendazol sulfon, dok je nakon dužeg vremena najzastupljeniji metabolit albendazol amonij sulfon. Stoga je markerski ostatak definiran kao suma udjela tri navedena metabolita te izražena kao ABZ. Najviše dopuštene količine (NDK) benzimidazola
prikazane su u tabeli 1.
2010.).
Metode određivanja ostataka benzimidazola
Najčešće metode koje se koriste za određivanje ostataka benzimidazola su kromatografske metode. Rjeđe se koriste biotestovi za detekciju ostataka benzimidazola u hrani, odnosno rutinski za procjenu učinka antiparazitskih lijekova. Zajednički pristup kod većine biotestova je prvotna separacija ostataka na ploči za tankoslojnu kromatografiju (TLC) te prskanje ploče s hranjivim agarom i otopinom koja sadrži indikatorski organizam. Prisutstvo benzimidazolnih ostataka dokazuje se zonom inhibiranog rasta na TLC ploči, a veličina zone je povezana s koncentracijom ostataka benzimidazola.
Tankoslojna kromatografija je prikladna tehnika za određivanje ostataka benzimidazola u hrani nudeći semikvantitativnu analizu. Tehnika se primjenjuje s ciljem smanjenja troškova određivanja ostataka benzimidazola u životinjskim tkivima.
Biotestovi su se pokazali jeftinim „screening“ testovima za određivanje benzimidazolnih ostataka u hrani, međutim potrebna su daljnja istraživanja na tom području (Brandon i sur., 1992.).
Imunoanalitičke metode mogu pružiti jednostavnu, osjetljivu i selektivnu detekciju benzimidazolnih ostataka u biološkim uzorcima. Tek nedavno je enzimska imunoanalitička metoda ELISA našla širu primjenu i preuzela radioimunološke metode. Postoji nekoliko značajnih radova o primjeni ELISA metode u analizi benzimidazola. Brandon i suradnici razvili su kompetativnu ELISA metodu za određivanje tiabendazola u jetri korištenjem monoklonalnih protutijela uzgajanih u miševima te fenbendazol u mlijeku (Brandon i sur., 1992., 2002.). Pripremljeni su hapteni za tiabendazol i 5-OH-tiabendazol i vezani na goveđi serumski albumin (BSA) koji je služio kao imunogen. Istraživači su uočili kako su protutijela uzgajana nakon imunizacije s konjugatima pripremljenim iz tiabendazola bila specifičnija za tiabendazol i 5-OH-tiabendazol, dok su se protutijela uzgajana iz konjugata pripremljenih s 5-OH- tiabendazol pokazala manje specifična.
Obzirom da se benzimidazolni lijekovi i njihovi metaboliti značajno razlikuju u fizičkim i kemijskim svojstvima razvijene su brojne kromatografske metode (Danaher i sur., 2007.). Većina tekućinskih kromatografskih metoda za određivanje ostataka benzimidazola razvijene su na kolonama punjenim sa silikagelom s kemijski vezanim obrnutim fazama (C8 i C18) i uz pokretnu fazu ionske supresije primjenom izokratne eluacije (Takeba i sur., 2000.), odnosno u većini metoda gradijentne eluacije (Roudaut i Garnier, 2000., Stubbings i sur., 2005., Bistoletti i sur., 2011.). Određivanje benzimidazola u mlijeku i tkivu rutinski se određuje korištenjem detekcije UV-detektorom te fluorescencijskim detektorom. U zadnjem desetljeću, primjenom tandemne spektrometrije masa (MS/MS) poboljšalo se određivanje ostataka benzimidazola u biološkim uzorcima.
Detekcija spektrometrijom masa koristi se kod određivanja ostataka benzimidazola u biološkim uzorcima, nudeći mogućnost za kombiniranu kvantitativno-potvrdnu metodu (De Ruyck i sur., 2002., Kinsella i sur., 2009., Whelan i sur., 2010., Chen i sur., 2011.). Primjenom navedenih metoda omogućeno je određivanje 10, 14 te čak 21 benzimidazolnih ostataka (Danaher i sur., 2003., Caprioli i sur., 2010., Chen i sur., 2010.).
Određivanje benzimidazola metodom plinske kromatografije (GC) je otežano zbog bazičnih svojstava i niske hlapljivosti analita. Metode plinske kromatografije u kombinaciji sa spektrometrom masa kao detektorom pokazale su se korisnom kao potvrdne metode za određivanje ostatka benzimidazola (Danaher i sur., 2007.).
Sažetak
Benzimidazolni lijekovi se primijenjuju u prevenciji i tretiranju parazitskih infekcija u agrikulturi i akvakulturi te kao fungicidi širokog spektra djelovanja.
Prvi su benzimidazoli korišteni u liječenju svih razvojnih stadija gastrointestinalnih nematoda bili albendazol, fenbendazol i oksfendazol. Kasnije su u primjenu uvedeni triklabendazol te zatim netobimin i febantel, veće topljivosti u vodi te povećane apsorpcije i biološke dostupnosti. Benzimidazoli se u živim organizmima metaboliziraju pri čemu nastaju metaboliti koji su znatno reaktivniji i toksičniji nego polazni lijek. Febantel i netobimin transformiraju u fenbendazol i albendazol.Provedene su studije farmakokinetike benzimidazola u životinjskim tkivima. Kod stoke i ovaca tretiranih s albendazolom, albendazol sulfoksidom ili netobiminom, pronađeno je da su albendazol sulfoksid i albendazol sulfon najzastupljeniji metaboliti koji prekoračuju najviše dopuštene vrijednosti (NDK). Albendazol amonij sulfon se pokazao kao najotporniji metabolit u tkivima koji se pojavljuje u masenim koncentracijama znatno ispod NDK. O doprinosu pojedinih fenbendazolnih ostataka u životinjskim tkivima vrlo se malo zna. Kod ovaca tretiranih s fenbendazolom kao glavni metabolit pojavljuje se oksfendazol. Kod stoke tretirane s fenbendazolom, fenbendazol je pronađen kao najzastupljeniji ostatak lijeka u kratkom vremenu nakon tretiranja uz manje koncentracije oksfendazola i fenbendazol sulfona. Ostatci polaznog lijeka flubendazola pronađeni su kao najzastupljeniji u jajima nesilica, dok je hidrolizirani metabolit flubendazola pronađen kao glavni metabolit u svinjskom i purećem tkivu. Kod stoke, koza i ovaca tretiranih s tiabendazolom, pokazalo se da je polazni lijek najzastupljeniji u jetri.
Metabolit 5-OH-tiabendazol pronađen je samo pri niskim koncentracijama, dok se kod peradi pokazao kao glavni metabolit.
Doprinos pojedinih metabolita ukupnim metabolitima triklabendazola u životinjskim tkivima nije istražen što ukazuje na potrebu za istraživanjem na tom području.
Benzimidazolni se ostatci mogu pojaviti usljed pogrešnog liječenja životinjske vrste, prevelike količine unesenog lijeka u odnosu na preporučenu dozu, nepoštivanja karence ili zbog toga što je životinja konzumirala kontaminiranu hranu.
Danas se za određivanje ostataka benzimidazola najčešće koriste kromatografske metode s UV i/ili fluorescencijskom detekcijom. U novije se vrijeme primjenom tandemne spektrometrije masa (MS/MS) poboljšalo određivanja ostataka benzimidazola u biološkim uzorcima zbog povećane osjetljivosti ove metode te određivanje 10, 14 te čak 21 benzimidazolnih ostataka. Razvoj novih metoda i njihova primjena osigurava sigurnost hrane životinjskog podrijetla, a time i zdravlje ljudi.
Literatura [… prikaži]
Benzimidazoles in food of animal origin
Marija DENZIĆ, BSc, Križevci Veterinary Institute, Križevci; Nina BILANDŽIĆ, BSc, PhD, Scientific Advisor; Croatian Veterinary Institute, Zagreb
Benzimidazoles are applied in the prevention and treatment of parasitic infections in agriculture and aquaculture, as well as for their broad-spectrum fungicide action. The first benzimidazoles used in the treatment of all developmental stages of gastrointestinal nematodes were albendazole, fenbendazole and oxfendazole. Later triclabendazole, netobimin and febantel were introduced, which featured increased water solubility and increased absorption and bioavailability. Benzimidazoles in living organisms metabolize to form metabolites that are much more reactive and toxic than the initial drug. Febantel and netobimin are transformed into fenbendazole and albendazole. Pharmacokinetic studies of benzimidazoles have been conducted in animal tissues. For cattle and sheep treated with albendazole, albendazole sulfoxide or netobimin, it was found that albendazole sulfoxide and albendazole sulfone were the predominant metabolites that exceed the maximum permitted levels. Albendazole sulfone ammonium proved to be most the resistant metabolite in tissues that occurs in mass concentrations well below the maximum permitted level. The contribution of individual fenbendazole residues in animal tissues is not clear. In sheep treated with fenbendazole, the main metabolite that appears is oxfendazole. In cattle treated with fenbendazole, fenbendazole was found as the most common drug residue in a short time after treatment with lower concentrations of oxfendazole and fenbendazole sulfone.
Residues of the initial drug flubendazol were found to be most common in the eggs of laying hens, while the hydrolyzed metabolite of flubendazol was found as a major metabolite in pork and turkey tissues. In cattle, goats and sheep treated with thiabendazole, the initial drug was found to be most common in the liver. The metabolite 5-OH-thiabendazole was found only at low concentrations, while poultry was the main metabolite. The contribution of individual metabolites of triclabendazole in animal tissues has not been investigated, indicating the need for further research in this area. Residues of benzimidazoles may occur due to the incorrect treatment of animals, drug concentrations applied in excess of the recommended dose, or withdrawal or failure as the animals consume contaminated food. Today, chromatographic methods with UV and/or fluorescence detection are commonly used for the determination of benzimidazoles. In recent years, the application of tandem mass spectrometry (MS/MS) has improved determination of benzimidazoles in biological samples due to the increased sensitivity of this method and the ability to determine 10, 14 and even 21 benzimidazole metabolites. The development of new methods and their application ensures the safety of foods of animal origin, and thus human health.
