Biomarkeri periodontalnih bolesti izdvojeni iz sline pasa

Šoštarić, P.¹*, K. Marić¹*, H. Valpotić², D. Brozić²

---

¹ Petra Šoštarić, Klara Marić, studentice, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, ² doc. dr. sc. Hrvoje Valpotić, dr. sc. Diana Brozić, Zavod za prehranu i dijetetiku životinja, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

▲

Sažetak

---

Klinički značajni biomarkeri periodontalnih bolesti, koji imaju ulogu u dijagnostici, terapiji i prognozi bolesti, moraju imati karakteristike sposobnosti klasifikacije periodontalnih promjena i praćenja učinka liječenja. Do danas nije provedeno istraživanje kojim bi se utvrdilo mogu li enzimski biomarkeri i razina ureje u slini pasa poslužiti kao dijagnostički medij kod periodontalnih bolesti.
Stoga je cilj ovog istraživanja bio odrediti koncentracije enzimskih biomarkera u slini pasa (ALT, AST i ALP) i ureje te utvrditi njihove koncentracije unutar skupina pasa različita stupnja zubnog kamenca i promjena na gingivi. U istraživanje je uključeno 20 zdravih pasa koji su podijeljeni u četiri skupine prema razini kamenca: K0, K1, K2, K3 i s obzirom na pregled gingive u dvije skupine: gingiva bez promjena (G0) i klinički promijenjena gingiva (Gprom).
Razina enzima ALT u slini nije se razlikovala između skupina, dok se koncentracija enzima AST u slini statistički značajno razlikovala između skupina K0 i K3 te K2 i K3. Koncentracija enzima ALP utvrđena je u znatno višoj koncentraciji u skupini K2 u usporedbi sa skupinama K0 i K1 te u skupini K3 ako ih usporedimo sa skupinama K0 i K1. Kod pasa kod kojih je utvrđen gingivitis, utvrđene su statistički značajno više vrijednosti za enzime ALT, AST, ALP. Koncentracija ureje u slini nije pokazala korelaciju s praćenim periodontalnim promjenama, stoga se ne može smatrati pouzdanim biomarkerom periodontalnih bolesti. Nasuprot tomu, enzimi ALT, AST i ALP pokazali su već utvrđene korelacije dokazane u slini kod ljudi, stoga ih možemo smatrati potencijalnim biomarkerima u dijagnostici i praćenju terapijskog učinka u liječenju periodontalnih bolesti kod pasa kao i potencijalnim dijagnostičkim modelom periodontalnih bolesti kod ljudi.
Ključne riječi: periodontalne bolesti, slina, enzimski biomarkeri, ureja, pas

▲

Salivary biomarkers for periodontal disease in dogs

---

Clinically relevant biomarkers of periodontal disease that have a role in diagnostics, therapy and prognosis must have the ability to classify disease and define follow-up treatment. To this date, no research has been conducted that could determine if enzymatic biomarkers and urea concentration in the saliva of dogs can serve as a diagnostic tool for periodontal disease. The aim of this research was to measure the salivary enzymes: ALT, AST and ALP, as well as urea, and to determine their concentrations in groups of dogs assigned according to calculus index and gingival inflammation. The study included 20 healthy dogs that were divided into groups according to calculus index (K0, K1, K2, K3) and according to the presence of gingivitis (G0 and Gprom) in which saliva enzymes (ALT, AST, and ALP) and urea were determined. The level of ALT in the saliva did not differ between groups, whereas AST concentration differed significantly between groups K0 and K3, and also between groups K2 and K3. We determined significantly higher concentrations of ALP in the K2 group compared to K0 and K1, and also in the K3 group compared to K0 and K1. In the group of dogs with gingivitis (Gprom) we determined significantly higher concentrations of the enzymes ALT, AST, and ALP. On the other hand the concentration of urea in saliva did not correlate with the periodontal pathologies observed, so it cannot be classified as a biomarker. In contrast, the enzymes ALT, AST and ALP already showed a correlation in human saliva with periodontal disease occurrence and severity, so they can be classified as potential biomarkers in periodontal disease diagnostics in dogs, as well as a potential diagnostic model for human periodontal pathologies.
Key words: periodontal disease, saliva, enzimatic biomarkers, urea, dog

▲

Uvod

---

Razvoj periodontalnih bolesti kod pasa započinje taloženjem bakterijskog plaka koji čine nakupine bakterija i produkti njihova metabolizma te ostaci epitelnih i upalnih stanica (Colmery i Frost, 1986.). Potom, mineralizacijom supragingivalnog i subgingivalnog plaka dolazi do formiranja zubnog kamenca čiji sastav čine kristalizirane soli kalcijeva karbonata i kalcijeva fosfata u slini na površini zuba (Legeros i Shannon, 1979.). Nakupljanje bakterijskog plaka i zubnog kamenca pogodovat će razvoju gingivitisa, reverzibilne upalne reakcije u kojoj ne dolazi do prekida kontinuiteta gingivalnog epitela na površini korijena zuba (Hennet i Harvey, 1992.). Daljnjim nakupljanjem plaka ispod gingivalnog epitela i njegove mineralizacije može doći do ireverzibilne destrukcije periodontalnog ligamenta, alveolarnog koštanog tkiva i posljedično ispadanja zuba te razvoja periodontitisa (Harvey, 1998.; Harvey, 2005.).

Velik je broj biološki aktivnih tvari koje nastaju tijekom formiranja zubnog plaka, kamenca, gingivitisa te periodontitisa, koje mogu poslužiti kao biomarkeri periopatogenog procesa.
Dijagnostika periodontalnih bolesti uglavnom se oslanja na klinički pregled i vizualnu inspekciju usne šupljine što je izazov u dijagnostici rane faze periodontalnih bolesti, dok se jasna klinička slika upale uočava kad već dođe do opsežnih, ireverzibilnih promjena u periodontalnim strukturama (Brinkmann i sur., 2011.).

Tijekom posljednja dva desetljeća u humanoj medicini slina služi za rano otkrivanje i kontrolu bolesti, određivanje koncentracije lijekova i drugih tvari u organizmu te dijagnostiku oralnih, autoimunosnih, kardiovaskularnih, zaraznih, zloćudnih i krvnih bolesti (Aurer i sur., 2005.). Razlog je tomu što je slina, za razliku od drugih tjelesnih tekućina, jednostavan, jeftin i neinvazivan dijagnostički medij (Malamud i Rodriguez-Chavez, 2011.). Slina je stoga sve privlačnija u dijagnostici periodontalnih bolesti, zbog lake dostupnosti te jednostavnog i neinvazivnog prikupljanja, a ponajviše zbog važnih enzima koji se oslobađaju nakon ozljede i smrti stanica poput alkalne fosfataze (engl. alkaline phosphatase, ALP), alanin-aminotransferaze (engl. alanine aminotransferase, ALT) i aspartat-aminotransferaze (engl. aspartate aminotransferase, AST) (Paknjad i Rezaei, 2013.).

Produkcija enzima pojavljuje se kao obrambeni odgovor na periodontalne bolesti te stoga može upućivati na oštećenje stanica u ranoj fazi bolesti, kada se ona klinički još nije očitovala (Luke i sur., 2015.). U dijagnostičke se svrhe najviše koristi nestimulirana slina koja je sastavljena od mješavine serozne i mukozne sline, tekućine iz gingivnog sulkusa i transudata seruma koji uz stanice epitela sluznice sadržava i krvne stanice, mikroorganizme te čestice hrane sa sluznice. Sastavni dijelovi sline potječu ponajprije iz okolnog krvožilnog sustava, stoga su mnogi spojevi koji se nalaze u krvi prisutni i u slini i na taj način odražavaju patološka stanja organizma (Farnaud i sur., 2010.). To joj svojstvo daje izniman potencijal za dijagnozu različitih bolesti (Miller i sur., 2010.). No slina kao dijagnostički medij ima i određene nedostatke, poput kontaminacije oralnim bakterijama koje će se prilikom prikupljanja sline naći u uzorku i na taj način utjecati na pojedine promatrane parametre. Nadalje, slina nije jednostavan ultrafiltrat plazme, već se proizvodi u sloju epitelnih stanica u acinusima žlijezda te se inicijalna sekrecija dalje modificira u duktusima, stoga će izlučena slina odražavati i njihov integritet (Miller, 1994.).

Klinički važni markeri periodontitisa koji bi imali ulogu u dijagnozi, terapiji i prognozi bolesti moraju imati karakteristike kao što su sposobnost klasifikacije periodontitisa te praćenje učinka liječenja (Brinkmann i sur., 2011.). Do danas nije provedeno istraživanje kojim bi se utvrdilo mogu li biomarkeri u slini pasa poslužiti kao dijagnostički medij kod periodontalnih bolesti i na taj način preuzeti ulogu modela za periodontalne bolesti kod ljudi. Naime, patofiziologija nastanka bolesti u pasa odgovara onoj u ljudi. Također, histološka svojstva zdravog i bolesnog periodonta vrlo su slična kod pasa i ljudi, a uz sve to se veže i visoka prevalencija bolesti u obje vrste (Lindhe i sur., 1975.; Albuquerque i sur., 2012.).

▲

Materijali i metode

---

Životinje

U istraživanje je uključeno 20 zdravih pasa u dobi od 10 mjeseci do 13 godina, različitih pasmina i oba spola, nasumičnim odabirom.
Nakon općeg kliničkog pregleda utvrđeno je da u trenutku pregleda psi nisu pokazivali znakove bolesti, s izuzetkom periodontalnih bolesti.
U trenutku uzimanja uzoraka psi nisu primali terapiju. Psima je potom učinjen pregled usne šupljine i procjena plaka, kamenca i gingive prema Loe-Silnessovoj ljestvici (LOE, 1967.) na temelju čega su podijeljeni u četiri skupine prema razini kamenca: kamenac nije prisutan (K0); supragingivalni kamenac prekriva manje od 1/3 krune (K1); supragingivalni kamenac prekriva više od 1/3 krune, ali manje od 2/3 krune, također prekriva cervikalni dio zuba (K2); kamenac prekriva više od 2/3 krune, cervikalni dio zuba i dio korijena (K3). S obzirom na pregled gingive psi su podijeljeni u dvije skupine: gingiva bez promjena (G0) i klinički promijenjena gingiva (Gprom), gdje su promjene varirale od blage upale s promjenom u boji, blagim edemom i bez krvarenja, do umjerene upale sa zacrvenjenom i edematoznom gingivom koja krvari na dodir i izrazito upaljenom gingivom s prisutnim edemom, ulceracijama, koja spontano krvari.

Prikupljanje uzoraka sline i analiza

Spontano izlučena slina sakupljala se u sterilne zubarske tampone koji su stavljani u usnu šuplinu u područje četvrtog maksilarnog premolara obostrano s bukalne strane. Prilikom uzorkovanja čeljusti su morale biti zatvorene da se onemogući gutanje tampona. Tampon se stavljao u epruvete SALIVETTE^® (Sarstedt, Njemačka) s citratom. Neposredno nakon uzorkovanja epruvete su centrifugirane u centrifugi Centric 400r u trajanju od 30 minuta na 5000 rpm (Tehtnica, Slovenija). Uzorci sline potom su razrijeđeni destiliranom vodom u omjeru 1 : 1 i analizirani metodom apsorpcijske spektrofotometrije na aparatu VetTest (Idexx, SAD) pri čemu su mjereni sljedeći parametri: ALT, AST, ALP i ureja.

Statistička analiza

Rezultati su obrađeni statistički, primjenom računalnog programa Statistica 2010 (Statistica, Tulsa, OK, USA) i prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SV ± SD) te grafičkim prikazom. Normalnost distribucije provjerena je Shapiro-Wilksovim testom. Značajnost razlika između skupina K0, K1, K2 i K3, čije vrijednosti nisu slijedile normalnu raspodjelu, utvrđena je Kruskall-Wallisovom analizom varijance i potom je Dunnovim testom utvrđena značajnost razlika između pojedinih skupina.
Značajnost razlika između skupina G0 i Gprom utvrđena je Mann-Whitneyevim U-testom. Razlike su se smatrale statistički značajnima ako je p < 0,05. ▲

Rezultati

---

Vrijednosti enzima u slini: ALT, AST, ALP te ureje prikazane su u tablici 1 kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Na slici 1 grafički su prikazani rezultati usporedbe koncentracije biokemijskih parametra u slini pasa: ureja, ALT, AST, ALP, na temelju klasifikacije prema utvrđenom indeksu kamenca (K0 – indeks kamenca 0, K1 – indeks kamenca 1, K2 – indeks kamenca 2, K3 – indeks kamenca 3).

Za koncentraciju ureje u slini utvrđena je statistički značajno viša vrijednost u skupini K0 u usporedbi s K1 (p < 0,05), dok između preostalih skupina nije utvrđena statistički značajna razlika. Razina enzima ALT u slini nije se razlikovala među skupinama, dok je kod koncentracija enzima AST u slini utvrđena statistički značajna razlika između skupina K0 i K3 te K2 i K3, gdje je utvrđena značajno viša koncentracija enzima AST u skupini K3 (p < 0,05). Koncentracija enzima ALP utvrđena je uznat no višoj koncentraciji u skupini K2 u usporedbi sa skupinama K0 i K1 te u skupini K3 akoih usporedimo sa skupinama K0 i K1. Nadalje, utvrđene vrijednosti praćenih biokemijskih pokazatelje: ureje, ALT, AST i ALP prikazane su u dvije skupine prema kliničkom statusu gingive (G0 i Gprom), kao srednja vrijednost ± standardna devijacija u tablici 2 i grafičkim prikazom na slici 2 gdje su uspoređene skupine pasa kod kojih nije bilo promjene na gingivi (G0) i psi kod kojih je utvrđen gingivitis (Gprom) te su utvrđene statistički značajno više vrijednosti za enzime ALT (p < 0,01), AST (p < 0,001) i ALP (p < 0,05) kod pasa s gingivitisom, dok za razinu ureje u slini nije utvrđena statistički značajna razlika među skupinama.

▲

Rasprava

---

Poput krvi, i slina je složena tekućina koja sadržava proteine, enzime, ione i druge molekule koje odražavaju fiziološki status organizma, stoga je u slini moguće odrediti i pratiti biomarkere poput enzima koji odražavaju upalni odgovor organizma (Aurer i sur., 2005.).

Enzim ALT ima vrlo važnu ulogu u metabolizmu aminokiselina, bjelančevina i ugljikohidrata. Lokaliziran je u citoplazmi stanica, a nalazi se u gotovo svim organima, osim u kostima i zubima. ALT je tipičan citoplazmatski enzim, a aktivnost mu se mijenja već pri promjeni propusnosti stanične membrane (Štraus, 2009.). Razina ALT-a nije odražavala opseg periodontitisa kod ljudi, no pri praćenju razineALT -a u slini kod gingivitisa utvrđena je korelacija (Totan i sur., 2006.; Dabra i sur., 2012.). Prema tome, kod pasa u skupini kod koje je utvrđen gingivitis (Gprom) pronađena je viša razina ALT-a, no kada su psi uspoređeni s obzirom na razinu zubnog kamenca, nije utvrđena značajna razlika među skupinama. Razlog tomu je što indeks kamenca ne podrazumijeva visok stupanj oštećenja periodontalnih struktura i zbivanje upalnog procesa, no predisponirajući je faktor koji može dovesti do razvoja gingivitisa i periodontitisa. Razina ALT-a u slini može biti važan pokazatelj uspješnosti liječenja gingivitisa jer odražava stupanj staničnog oštećenja i upale tkiva (Nomura i sur., 2012.).

Enzim AST nalazi se u mnogim tkivima, uključujući srce, mozak, pluća, mišiće i bubrege.
Što se tiče lokalizacije unutar same stanice, 40 % enzima nalazi se u citoplazmi, a 60 % u mitohondrijima, te su to ujedno i njegova dva izoenzima (Štraus, 2009.). Razina AST-a poveuana je s aktivnom destrukcijom tkiva, pa tako i periodontalnog tkiva, jer se nalazi u citoplazmi te se oslobađa prilikom smrti stanica (Todorović i sur., 2006.). Varijacija koncentracije AST-a u slini, kada uspoređujemo različite stupnjeve razvoja periodontalnih bolesti kod ljudi, ne pokazuje značajnu povezanost s kliničkim parametrima kao što su stvaranje plaka i stupanj promjena na gingivi te krvarenja, no kod opsežnije kliničke slike gingivitisa i periodontitisa utvrđene su značajno više koncentracije AST-a u slini (Cesco Rde i sur., 2003.). Tijekom našeg istraživanja utvrđena je značajno viša razina AST-a kod pasa s gingivitisom u usporedbi sa psima čija gingiva nije bila klinički promijenjena, dok se razina AST-a u slini prilikom usporedbe pasa na temelju indeksa kamenca razlikovala između onih s najvišim indeksom (K3) i skupina K0 i K2. Taj podatak odgovara pretpostavci da je korelacija razine AST-a u slini između opsežnih periodontalnih promjena i zdravih jedinki veća od one zabilježene kod blažih promjena (Dewan i Bhatia, 2011.) Razina AST-a kod periodontitisa povezana je s promjenama tkiva zahvaćenih nekrozom. Naime, fibroblasti podrijetlom iz periodontalnog ligamenta stvaraju znatno manju količinu AST-a nego gingivalni epitel, rezultat čega je povećanje razine AST-a u slini kao posljedica citolize periodontalnih stanica i/ili krvarenja zubnog mesa (Totan i sur., 2006.).
To je u skladu s istraživanjima koja dokazuju pozitivnu korelaciju inteziteta i opsega upale periodontalnih struktura i koncentracije AST-a u slini (Chambers i sur., 1991.; Totan i sur., 2006.; Podzimek i sur., 2016). Nakon provedbe terapije koja je rezultirala smanjenjem upale zahvaćenih strukura dolazi do pada razine AST-a u slini što ga čini pogodnim biomarkerom za praćenje uspješnosti terapije periodontalnih bolesti (Nomura i sur., 2012.).

Enzim ALP se u organizmu nalazi u multimolekularnim oblicima od kojih su neki izoenzimi, a drugi izoforme nastale nakon sinteze enzima, te se govori o jetrenom, koštanom, crijevnom, bubrežnom i placentarnom ALP-u (Štraus, 2009.).
ALP je enzim membrana stanica koji hidrolizira veze monofosfatnih estera pri lužnatom pH, povećavajući koncentraciju fosfatnih iona lokalno, te ima bitnu ulogu u građi periodonta jer je fiziološki dio periodontalnog ligamenta, gradi korijen i održava čvrstoću zuba te sudjeluje u homeostazi kosti (Loos i Tjoa, 2005.). Povećanje koncentracije ALP-a u slini upućuje ne samo na prisutnost patološkog procesa nego i na destruktivne procese kojima je zahvaćena i alveolarna kost, upućujući na znatno uznapredovalu periodontalnu bolest s lošijom prognozom (Todorović i sur., 2006.; Yoshie i sur., 2007.). ALP u slini može biti podrijetlom i iz leukocitnih granula i iz mikroorganizama u usnoj šupljini, uključujući gram-negativne uzročnike u subgingivalnom plaku. Zbog toga su kod gingivitisa i periodontitisa ljudi utvrđene značajno više razine ovog enzima u slini nego kod zdravih kontrola (Dabra i Singh, 2012.). Naime, ALP otpuštaju sekundarne granule neutrofila, a koncentracijam u značajno raste s taloženjem plaka i pojačanjem upale (Kumar i Sharma, 2011.). Važnost ALP-a kao upalnog biomarkera periodontalnih bolesti dokazali su Ishikawa i Cimasoni (1970.) utvrdivši značajnu korelaciju (r = 0,49; p < 0,05) razine ALP-a u tekućini iz gingivalnog sulkusa i dubinu gingivalnog sulkusa. U skladu s tim, nakon liječenja periodontitisa primijećeno je da se koncentracija ALP-a u slini kod ljudi smanjuje te su zabilježene vrijednosti na razini onih utvrđenih kod zdravih ljudi, što ga čini prikladnim biomarkerom za praćenje uspješnosti terapije periodontalnih bolesti (Zambon i sur., 1985.; Yan, 1995.; Numabe i sur., 2004.). Ti su rezultati u skladu s našim istraživanjem gdje su utvrđene značajno više koncentracije ALP-a u slini kod pasa s višim indeksom kamenca (K2 i K3) u usporedbi sa psima bez zubnog kamenca (K0) i kod pasa gdje je indeks kamenca bio 1 (K1). Također, razina ALP-a kod gingivitisa bila je značajno viša nego kod pasa čija gingiva nije pokazivala znakove upale. Mjerenjem razine ureje u slini kod ljudi utvrđeno je da ima visoku osjetljivost i specifičnost u korelaciji s periodontalnim bolestima kod ljudi (0,62 i 0,63) te su utvrđene značajno više koncentracije u bolesnika s gingivitisom i periodontitisom (Nomura i sur., 2012.; Luke i sur., 2015.). No, u našem istraživanju ureja u slini nije pokazala karakteristike biomarkera periodontalnih bolesti kod pasa. Naime, u skupini pasa K0 utvrđena je značajno viša koncentracija ureje u slini u usporedbi sa skupinom K1, dok kod preostalih skupina nije zabilježena značajnost razlike u koncentracijama. Također, između skupina pasa s gingivom bez promjena (G0) i skupine kod koje je utvrđen gingivitis (Gprom) nisu zabilježene statistički značajne razlike. Razlike u rezultatu utvrđenom kod ljudi i onih kod pasa mogu se objasniti razlikom u sastavu i pH-vrijednosti sline čovjeka i psa, što upućuje na različit metabolizam žlijezda slinovnica između vrsta (Lavy i sur., 2012.). Također, na izlučivanje ureje putem slinskih žlijezda kod pasa utječe razina salivacije i mjesto prikupljanja sline jer je koncentracija ureje različita u parotidnoj i mandibularno-sublingvalnoj slini, stoga sam postupak uzorkovanja kod subjekata uključenih u istraživanje može pridonijeti varijabilnosti rezultata (Zambon i sur., 1985.). Enzimski biomarkeri iz sline određuju se u humanoj medicini kako bi se utvrdilo postoji li povezanost njihove razine i periodontalnih bolesti, no kod pasa slina se još uvijek premalo koristi kao dijagnostički medij. Također, do danas nije provedeno istraživanje koje bi dokazalo opravdanost korištenja upalnih biomarkera (ALT-a, AST-a, ALP-a i ureje) u slini. Rezultati provedenog istraživanja upućuju na značajne razlike u koncentraciji enzima među promatranim skupinama, dok kod ureje nisu zabilježeni rezultati na temelju kojih je moguće ustanoviti povezanost opsega periodontalne bolesti kod pasa i koncentracije ureje u slini. ▲

Zaključci

---

1. Koncentracija enzimskih upalnih biomarkera, AST i ALP kod pasa odražava indeks zubnog kamenca i opravdava njihovo korištenje kao pouzdanih biomarkera u praćenju periodontalnih bolesti.
2. Razina ALT-a u slini kod pasa nije se razlikovala prema opsežnosti zubnog kamenca, stoga nije dovoljno osjetljiv biomarker u praćenju periodontalnih bolesti u početnom stadiju njihova nastajanja.
3. Razine enzimskih biomarkera (ALT, AST i ALP) u slini pasa pouzdan su biomarker kod upalnih promjena gingive stoga potvrđuju mogućnost korištenja psa kao modela gingivitisa kod ljudi.
4. Koncentracija ureje u slini pasa nije slijedila korelaciju dokazanu kod ljudi u svrhu praćenja periodontalnih bolesti, stoga se ne može smatrati prikladnim biomarkerom.
5. Jednostavni i robustni enzimski biomarkeri ALT, AST i ALP iz sline pasa pogodni su biomarkeri periodontalnih bolesti koji se mogu koristiti za praćenje uspjeha terapije te u istraživanju i razvoju novih pripravaka za lokalnu primjenu.

Literatura [… prikaži]

---