Izv. prof. dr. sc. Lorena Jemeršić
Hrvatski veterinarski institut
Izvor: Brošura “Afrička svinjska kuga”, 10. travnja 2019.
6. Dijagnostika virusa ASK
Klinička slika
Klinički znakovi ASK nisu specifični i temeljem njih je moguće samo posumnjati na infekciju. Ovisno o virulenciji virusa, inkubacija ASK iznosi 4-19 dana, a moguća je i značajno duža inkubacija u trajanju i do dva mjeseca.
ASK se javlja perakutnim tijekom kada je jedini znak infekcije povećan broj uginuća svinja.
Akutni tijek bolesti se očituje općim infektivnim sindromom, odnosno groznicom (40,5-42,0 °C) i gubitkom apetita, a svinje se ne glasaju i skupljaju u hrpe.
Nekoliko dana potom, javljaju se krvarenja kože uški, repa, nogu i ventralnog djela abdomena .
Krvnom slikom prevladavaju leukopenija i trombocitopenija. Javlja se cijanoza sluznica i u terminalnoj fazi bolesti, dan do dva prije uginuća, nekoordinirano kretanje i ataksije. Ponekad se javljaju i konjunktivitis, iscjedak iz nosnica, povraćanje (uz primjese krvi) i proljev, te pobačaji u gravidnih krmača.
Uginuće nastupa 6. do 13., najkasnije 20. dana od infekcije kada ugiba i do 100% inficiranih svinja. Ovaj oblik bolesti uzrokuju jakovirulentni sojevi virusa ASK. U divljih svinja moguće je primijetiti veći broj uginuća, odnosno kržljavaca.
Patološko-anatomski nalaz odgovara kliničkom očitovanju bolesti: krvarenja po koži i sluznicama; mukopurulentni sadržaj oko konjunktiva; nalaz eksudata u perikardu, peritoneumu i pleuri; petehijalna krvarenja svih mukoza; punokrvnost parenhimatoznih organa; petehijalna krvarenja sluznica organa mokraćnog sustava, naročito srži bubrega i mokraćnog mjehura; krvarenja u limfnim čvorovima; kongestija pluća te krvavi tekući sadržaj u probavnom sustavu (Plowright i sur., 1994).
Subakutni i kronični tijek bolesti očituju se pojavom znakova bolesti 14., pa i do 45. dana nakon infekcije a karakterizira ih intermitentna groznica, slabiji prirast, pobačaji u gravidnih krmača, te simptomi od strane dišnog i probavnog, a ponekad i živčanog sustava (Penrith i sur., 2004). Ukoliko je uzročnik infekcije slabovirulentan soj virusa, simptomi mogu nastupiti i do dva mjeseca nakon infekcije i nisu specifični (dišne i probavne infekcije, slabiji prirast, neplodnost i sl.). Tada je letalitet 30-70%, dok svinja doživotno izlučuje virus.
Diferencijalno dijagnostički treba svakako isključiti klasičnu svinjsku kugu. ASK se od KSK može razlikovati istodobnom pojavom infekcije u svinja svih uzrasta, dok je za KSK karakteristična veća osjetljivost prasadi. Nadalje, najviše je dokazanih novih slučajeva ASK u domaćih svinja u ljetnim mjesecima (lipanj-kolovoz), dok se u divljih svinja javlja u razdoblju od lipnja do srpnja, te u studenom i prosincu (Chenais i sur., 2019). KSK nema sezonski karakter.
Treba isključiti i druge klinički srodne bolesti poput cirkovirusne infekcije svinja, reproduktivnog i respiratornog sindroma u svinja, vrbanca, pastereloze, salmoneloze, aflatoksikoze te trovanja.
ASK je pri prvoj pojavi na području Kavkaza i Rusije bila zamijenjena cirkovirusnom infekcijom svinja, što je produljilo vrijeme širenja infekcije.
Laboratorijske metode dijagnosticiranja ASK
Kako bi laboratorijsko testiranje bilo valjano, treba u laboratorij dostaviti i odgovarajući materijal za pretraživanje (krv kojoj je dodan antikoagulans, serum, koštana srž, slezena, limfni čvorovi, tonzile i/ili bubreg). Materijal treba dostaviti najbrže moguće u rashlađenim uvjetima (4 do 8 °C), ali bez smrzavanja.
Uz materijal je potrebno dostaviti detaljno ispunjene obrasce i popratnu dokumentaciju.
Danas se najsigurnija dijagnoza ASK postavlja usporednim testiranjem pomoću lančane reakcije polimerazom za dokaz virusne DNK i imunoenzimnog testa za dokaz anti-ASK protutijela.
■ Izravno dokazivanje virusa ASK
a) Izolacija virusa i hemadsorpcijski test
Izolacija virusa na staničnim kulturama se provodi za potvrdu sumnje na ASK.
Ovim se testovima mogu utvrditi i titrevi virusa u zaprimljenom materijalu ukoliko se uzorak serijski razrjeđuje.
Ipak, njihova je upotreba u dijagnostici ASK ograničena, a osjetljivost daleko manja nego pri primjeni molekularnih metoda.
Razlog tomu je potreba za visokim titrom intaktnog virusa ASK u zaprimljenom materijalu, a sam materijal mora biti svjež, jer autoliza onemogućuje rast virusa in vitro (Gallardo i sur., 2015).
Nadalje, za provedbu ovih metoda potrebno je u laboratorijima osigurati uvjete biosigurnosne razine 3. ili 4., obzirom na primjenu standardnog, živog i virulentnog kontrolnog soja virusa, a same su metode zahtjevne, podložne subjektivnoj interpretaciji rezultata, dugotrajne i skupe. Stoga nisu preporučene u svakodnevnoj primjeni ili provedbi monitoring programa već se koriste za dodatne ili potvrdne metode.
b) Imunofluorescentni test (IF)
IFom se dokazuju specifični antigeni virusa ASK u tkivu ili leukocitima uginulih/živih svinja. Koristan je kada postoji opravdana sumnja na ASK, a izolacija virusa i hemadsorpcijski test nisu polučili pozitivan rezultat. Za provedbu metode potrebni su adekvatni reagensi (fluorescentni izotiocijanatni anti-virusni ASK konjugat) i mikroskop s fluorescentnim filtrom. Postupak je brz i specifičan. Međutim, ova metoda ne pokazuje dovoljnu osjetljivost ukoliko je virus u uzorku prisutan u niskom titru, kao što je slučaj tijekom inkubacije ili kod subakutnih i kroničnih infekcija. U pravilu se rijetko koristi u državama EU.
c) Imunoenzimni test za dokazivanje antigena virusa ASK (Ag ELISA)
Dosadašnja istraživanja i validacije Ag ELISA za ASK su vrlo ograničena i temeljena su na rezultatima testiranja provedenim pomoću afričkih izolata virusa.
Stoga je nakon pojave ASK na području Europe testiran jedini tržišno dostupan Ag ELISA komplet i to usporedbom s molekularnim metodama pretraživanja terenskih uzoraka i primjenom europskih izolata virusa ASK. Osjetljivost Ag ELISA se pokazala vrlo niskom (77.2%) ukazujući na činjenicu da kakvoća materijala pristigla s terena utječe na kvalitetu polučenih rezultata (Gallardo i sur., 2015). Ujedno nastanak imunokompleksa antigen-protutijelo u seropozitivnih svinja inhibira vezivanje antigena virusa za konjugat, čime se osjetljivost testa dodatno može umanjiti. Zbog navedenih osobitosti, Ag ELISA nije metoda izbora za dijagnostiku ASK. Međutim, Ag ELISA je jeftina i brza metoda koja se može provoditi i automatiziranim uređajima. Nadalje, svinje s područja Europe nakon uginuća sadrže velike količine antigena virusa ASK, što omogućuje prepoznavanje prisutnosti virusa pri mnoštvenim pretraživanjima. Nacionalni referentni laboratorij (NRL) Republike Hrvatske za dijagnostiku klasične i afričke svinjske kuge pri Hrvatskom veterinarskom institutu u Zagrebu u svom radu i tijekom monitoringa koristi i Ag ELISA, ali samo kao dodatnu metodu dokazivanja virusa ASK.
d) Molekularne metode dokazivanja ASK
Primjena molekularnih metoda dijagnostike ASK ima za cilj prepoznati vrlo postojane regije DNK virusa, kako bi se sa sigurnošću u ispitivanom materijalu dokazali svi poznati genotipovi i podgenotipovi virusa neovisno o visini titra, uključujući i sojeve koji ne pokazuju hemadsorpcijsko svojstvo, kao i one slabe virulencije. Danas su molekularne metode osnova dijagnostike ASK, jer su dokazano najosjetljivije i najspecifičnije, te su dodatno i metode odabira pri monitoringu u država koje su slobodne od infekcije. Molekularnim je metodama moguće dokazati virus u krvi, serumu, brisevima sluznica, ekskretima i sekretima inficiranih svinja, tkivima i organima, pa čak i kada je započeta samorazgradnja istih. Nadalje, primjenom konvencionalnih PCR metoda dobiva se DNK proizvod za genotipizaciju virusa.
OIE i EURL preporučuju nekoliko protokola od kojih se najčešće koriste konvencionalna, umrežena lančana reakcija polimerazom ili konvencionalni PCR (preporuka OIE), lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu ili RT-PCR (dvije metode, preporuka OIE i EURL) i konvencionalni PCR temeljen na varijabilnijoj regiji DNK molekule sa svrhom potvrde bolesti i naknadne genotipizacije (Tablica 1.).
Usporedbenim testiranjem osjetljivosti i specifičnosti navedenih metoda i to pomoću europskih izolata virusa ASK dokazana je najviša osjetljivost UPL RT-PCR metode (EURL), dok je specifičnost svih testiranih metoda bila jednaka. Ovom je metodom prepoznat virus divljih svinja u kojih su prethodno utvrđena protutijela, kao što je i dokazana i prisutnost litvanijskog izolata izdvojenog iz asimptomatskih svinja, kojeg druge metode nisu prepoznale (Gallardo i sur., 2015.).
Stoga je upravo ova metoda preporučena od strane EURL za monitoring i dijagnostiku ASK, pogotovo jer prepoznaje virus u svinja koje su u inkubaciji ili rekonvalescenciji, te kronično inficiranih svinja.
NRL Hrvatske koristi u svojem radu sve tri metode molekularne dijagnostike, s temeljem u primjeni UPL RT-PCR metode (EURL).
S ciljem analize nukleotidnih slijedova i genotipizacije sojeva virusa ASK mora se provesti i konvencionalni PCR protokol, odnosno umreženu lančanu reakciju polimerazom te potom i samu analizu slijedova. NRL obavlja i tu konvencionalnu PCR metodu. Tipizacija sojeva virusa ASK se danas provodi analizom nekoliko regija genoma od čega najčešće analizom p72-p54-CVR i odsječka unutar B646L gena koji kodira za kapsidni protein (p74).
■ Neizravno dokazivanje virusa ASK
Nakon indukcije humoralne imunosti srednje i slabovirulentnim sojevima virusa ASK, protutijela su dokaziva u serumu, eksudatima i sekretima inficiranih svinja.
a) Imunoperoksidazni test (IPT)
Zbog svoje visoke osjetljivosti i specifičnosti ovaj je test preporučeno koristiti za potvrdni test kada se drugim serološkim metodama poluči pozitivan rezultat u područjima slobodnima od ASK, odnosno u endemskim područjima ukoliko drugi testovi poluče nejasan rezultat.
IPT se koristi u NRL za potvrdni test, kao što je i preporučeno.
b) Imunoenzimni testovi (Ab ELISA)
Na području Europe najčešće od svih metoda za dijagnostiku ASK koristi se upravo imunoenzimni test za dokazivanje anti-ASK protutijela. On omogućuje mnoštveno pretraživanje velikog broja seruma u relativno kratkom vremenu.
Nezaobilazna je metoda tijekom provođenja monitoring programa, ali služi i kao dijagnostički alat. Na tržištu EU su dostupna četiri komercijalna kompleta za provedbu imunoenzimnog testa: neizravna ELISA, temeljena na polupročišćenom antigenu virusa ASK, a čiji je protokol razvio OIE; blokirajuća Ingenasa-ELISA, temeljena na monoklonskim protutijelima za protein p72 virusa (Ingenasa-Igezim PPA COMPAC K3; Ingenasa, Madrid, Španjolska); neizravna ID-vet-ELISA koja se temelji na više antigenskih osnova za proteine p32, p62 i p72 (ID Screen African swine fever indirect assay, Grabels, France) i neizravna Svanova ELISA temeljena na rekombinantnom proteinu p30 virusa ASK (Svanovir ASFV-Ab Boehringer Ingelheim Svanova, Uppsala, Švedska).
Premda su svi navedeni kompleti dostupni na području Europe, njihovom se usporedbom utvrdilo da je Ingezim ELISA najosjetljiviji komplet trenutno na tržištu, te ga koristi i akreditiran je od strane NRL Hrvatske.
c) Imunoblotting (IB)
NRL koristi IB metodu od 2010. godine.
Dijagnostika ASK u Hrvatskoj
NRL Hrvatske provodi stalnu kontrolu domaćih i divljih svinja na prisutnost virusa i specifičnih protutijela za virus ASK, a u skladu s aktivnim i pasivnim nadzornim programom kojeg na godišnjoj ravni propisuje Ministarstvo poljoprivrede, Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane. Zbog održavanja i unaprjeđivanja kvalitete rada, djelatnici laboratorija pohađali su radionice za dijagnostiku ASK u EURL za dijagnosticiranje ASK u Madridu, Španjolska, te Nacionalnom Referentnom Laboratoriju za ASK u Ljubljani, Slovenija. Laboratorij redovito i uspješno sudjeluje u međunarodnom međulaboratorijskom testiranju (ILCT) kojeg organizira EURL na godišnjoj ravni, slijedećim metodama:
- Imunoenzimni test za dokazivanje protutijela za virus ASK (Ab ELISA);
- Imunoenzimni test za dokazivanje antigena virusa ASK (Ag ELISA);
- Klasični PCR za dokazivanje odsječka unutar genoma virusa ASK;
- Tri metode kvantitativnog PCR protokola u stvarnom vremenu (RT-PCR) te
- Imunoperoksidazni test (IPT) i imunoblotting test (IB) za potvrdne serološke testove.
Treba naglasiti da je RH među prvim državama u Europi koja je propisala aktivno nadziranje ASK (2010. i 2011. godine), a koje je podrazumijevalo serološko (Ab ELISA) i virološko (PCR i RT-PCR) pretraživanje krvi i organa divljih (1%) i domaćih (3%) svinja dostavljenih u laboratorij zbog pretraživanja na klasičnu svinjsku kugu. Nakon 2011. provodi se pasivno nadziranje koje se temelji na obveznom pregledu svih uginulih domaćih i divljih svinja RT-PCR metodom. Godine 2016., obnavlja se aktivni monitoring i nastavlja do 2018. prvenstveno zbog slabog odaziva u slanju materijala tijekom trajanja isključivo pasivnog monitoringa (Slika 22).
NRL je povećao i kapacitete rada edukacijama djelatnika veterinarske službe putem organizacije radionica i osposobljavanjem djelatnika Hrvatskog veterinarskog instituta (Podružnica) za provođenje Ab ELISA testa kako bi u slučaju pojave infekcije bilo moguće brzo i sigurno primijeniti aktivni nadzorni program. Ujedno je Hrvatski veterinarski institut na zahtjev NRLa omogućio nabavu strojeva za automatsko izdvajanje RNK/DNK, te za automatsku provedbu ELISA testa čime je omogućeno mnoštveno pretraživanje, te je povećan radni kapacitet laboratorija.
Djelatnici NRLa su aktivno uključeni u COST akciju: ‘ASF-STOP’, Understanding and combating African Swine Fever in Europe (CA15116), financiranu sredstvima EU. Najnovija istraživanja i podatci vezani za aktivnosti COST akcije su dostupni na mrežnoj poveznici: http://www.asf-stop.com/.