Ivana Giovanna Zupičić*, Željko Pavlinec, Dražen Oraić i Snježana Zrnčić
Ivana Giovanna ZUPIČIĆ*, dr. vet. med., asistentica, (e-mail: zupicic@veinst.hr), Željko PAVLINEC, mag. biol. mol., asistent, dr. sc. Dražen ORAIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, dr. sc. Snježana ZRNČIĆ, dr. med. vet, znanstvena savjetnica, Hrvatski veterinarski institut Zagreb, Hrvatska
SažetakUvodZoonotski potencijalSvojstva bakterije V. harveyiMehanizam patogenostiČimbenici virulencijeEpizootiologijaKlinički simptomiDijagnostikaLiječenje i preventivaZaključciLiteraturaAbstract
Sažetak
B akterije roda Vibrio spp. su najčešći uzročnici bolesti akvatičnih životinja.
Pripadaju porodici Vibrionaceae u kojoj je jedan od najznačajnih predstavnika klad Vibrio harveyi. V. harveyi se uobičajeno nalazi u morskom okolišu i predstavnik je normalne flore akvatičnih životinja. Brojni sojevi su opisani kao uzročnici bolesti morskih rakova i školjkaša. U posljednje vrijeme V. harveyi nanosi velike štete u uzgoju mediteranskih vrsta riba, posebice u ljetnim mjesecima. V. harveyi je gram-negativna, halofilna, aerobna ili fakultativno anaerobna, načelno nije zoonotska bakterija, međutim zabilježeni su izdvojeni slučajevi oboljenja ljudi. Neki sojevi su visoko patogeni dok se drugi smatraju uvjetno patogenima. Glavni čimbenici virulencije su bičevi, litički enzimi, kapsula, siderofore, hidrofobni površinski antigeni i sposobnost prianjanja i infekcije epitelnih stanica domaćina. Sposobnost stvaranja biofilma omogućava rezistenciju na antibiotike, a sposobnost bakterija da izvlače željezo iz stanica domaćina je ključna za njihovo preživljavanje. Intracelularni sustav omogućava međustaničnu komunikaciju bakterija. Klinički znaci su slični drugim bakterijskim infekcijama u riba, a obično započinju letargijom i gubitkom apetita.
V. harveyi posjeduje urođenu rezistenciju na neke antibiotike. U novije se vrijeme razvija bakteriofagna terapija koja je daje obećavajuće rezultate. Cijepljenje je jedan od najučinkovitijih načina prevencije bolesti i metoda redukcije gubitaka i smanjenja uporabe antibiotika. Dobra proizvođačka praksa koja podrazumijeva optimalne uvjete u uzgojnim jedinicama kao i primjena mjera biosigurnosti su važni u spriječavanju ulaska uzročnika bolesti u farmu i širenja na sve uzgojne jedinice. Sve češće se javljaju infekcije visoko patogenim emergentnim sojevima Vibrio harveyi. Uzevši u obzir činjenicu da je V. harveyi moguće izdvojiti iz okoliša, morskih organizama i probavnog trakta zdravih jedinki, očito je da postoje različiti sojevi iste bakterijske vrste te je potrebno definirati razlike između apatogenih i patogenih sojeva.
Ključne riječi: V. harveyi, bakterije, liječenje, profilaksa
Uvod
Bakterija V. harveyi je prvi puta opisana kao Achromobacter harveyi (Johnson i Shunk, 1936.) i imenovana po E. N. Harvey-u koji je proučavao luminiscenciju bakterija. Nakon toga je pripojena rodu Lucibacterium (Hendrie i sur., 1970.), zatim rodu Beneckea (Reichelt i Baumann, 1973.), a tek kasnije rodu Vibrio unutar porodice Vibrionaceae (Baumann i sur., 1981.). Znatno kasnije, 1990-ih, V. harveyi je opisan kao uzrok infekcija i mortaliteta s posljedičnim ekonomskim gubicima u akvakulturi Sjeverne Amerike (Alvarez i sur., 1998.), Australije (Pizzuto i Hirst, 1995.) i Azije (Jiravanichpaisal i sur., 1994.). Zabilježeni su znatni mortaliteti u uzgoju larvalnih stadija tigraste kozice (Penaeus monodon) i kuruma kozice (Penaeus japonicus) koji su se penjali do 100 % (Liu i sur., 1996. a,b).
Austin i Zhang (2006.) definiraju V. harveyi kao emergentnog uzročnika bolesti u globalnoj akvakulturi. Opisan je kao sve češći uzročnik bolesti uzgajanih riba u suptropskoj regiji te je opisan u kirnje (Epinephelus awoara) (Qin i sur., 2006.), azijskog lubina (Lates calcarifer) (Tendencia, 2002.), vrste pompano (Trachinotus blochii) (Pakingking i sur., 2018.), školjkaša i rakova (Karunasagar i sur., 1994., Lavilla-Pitogo i sur., 1998., Nishimori i sur., 1998.). Nadalje, smatra se jednom od najznačajnijih patogenih bakterija u kineskoj akvakulturi (Cui i sur., 2014., Chen i sur., 2004., Li i Xu, 1998., Zhang i sur., 2010.). V. harveyi je teško iskorijeniti, a uporaba antibiotika može rezultirati razvojem antimikrobne rezistencije (Karunasagar i sur., 1994.).
Dominantna je heterotrofna vrsta izdvojena iz morskih školjkaša u toplijem dijelu godine u zapadnom Mediteranu. U Europi, posebice Mediteranu javlja se kao znatan uzročnik bolesti lista (Solea sp.) (Rico i sur., 2008.) i lubina (Dicentranchus labrax) (Pujalte i sur., 2003.). Isti autori potvrđuju da je V. harveyi jedna od najučestalijih Vibrio vrsta u morskoj vodi i školjkašima zapadnog Mediterana.
Njihova istraživanja su pokazala da je prevalencija infekcije V. harveyi viša u lubina nego komarče. Infekcije vrstom V. harveyi se češće javljaju u toplije vrijeme godine, a u ostatku godine ih gotovo i nema.
Zoonotski potencijal
Nadalje, opisan je i slučaj rane na tibiji njemačkog pacijenta, zadobivene nakon pada s plovila u Australiji, bakterijama V. harveyi i Photobacterium damselae (Hundenborn i sur., 2013.). Nedavno je izvješteno o infekciji rane na tibiji u odraslog Španjolca zadobivene tijekom silaska s autobusa u Dominikanskoj Republici. Nakon povratka u Španjolsku zatražio je liječničku pomoć te je iz rane izdvojena i identificirana bakterija V. harveyi (Del Gigia-Aguirre i sur., 2017.).
Svojstva bakterije V. harveyi
Fermentira ugljikohidrate i tvori kiseline, ali ne plinove. Tvori 3-butanediol, reducira nitrate i različite enzime kao što su: katalaza, oksidaza, beta-galaktozidaza i arginin dihidrolaza.
Najznačajnija karakteristika ove vrste i princip temeljem kojeg se u laboratorijskoj dijagnostici najlakše može razlikovati od bakterija roda Aeromonas je osjetljivost na vibriostat pteridin 0/129, koji inhibira njihovu multiplikaciju.
Mehanizam patogenosti
- bakterija pomoću kemotaktične pokretljivosti ulazi u tkivo domaćina,
- u tkivu domaćina bakterija razvija sustav za izdvajanje željeza iz tkiva domaćina,
- bakterija oštećuje domaćina tvorbom ekstracelularnih tvari (Themptander, 2005.).
Infekcija započinje u crijevu i bakterije krvotokom putuju u druge organe te na taj način prouzroče generaliziranu infekciju i posljedičnu smrt ribe (Thompson i sur., 2004.).
Čimbenici virulencije
Smatra se da su glavni čimbenici virulencije bičevi koji omogućavaju njenu pokretljivost, litički enzimi (hemolizini, serinske proteaze, metaloproteaze, cisteinske proteaze, hitinaze, fosfolipaze i lipaze), kapsula, siderofori koji pomažu vezivanje željeza, prisutnost hidrofobnog površinskog antigena, sposobnost prianjanja i infekcije epitelnih stanica domaćina (Wang i Leung, 2000., Ruwandeepika i sur., 2012.) kao i sposobnost stvaranja biofilma koja im omogućava rezistenciju na anibiotike i dezinficijense (Karunasagar i sur., 1994.). Sposobnost bakterija je ključna za njihovo preživljavanje da izvlače željezo iz stanica domaćina (Ratledge i Dover, 2003.). Jedan od najznačajnijih koraka u virulenciji je prijanjanje bakterije na površinu stanica domaćina koje je regulirano makromolekulama zvanim adhezini. Bakterije iz porodice Vibrionaceae prijanjaju uz kolagen, fibronektin, riblju sluz i epitelne stanice.
Adhezija bakterija roda Vibrio nije još u potpunosti razjašnjena. Internalizacija i citotoksičnost su važni čimbenici virulencije, a ekspresija adhezina može biti ovisna o okolišnim čimbenicima i o receptorima na stanicama domaćina (Wang i Leung, 2000.).
Gram-negativni štapići komuniciraju putem intracelularnog sustava koji je prvi puta otkriven na bakteriji Vibrio fischeri (Pesci i Iglewski, 2003.). Međustanična komunikacija (engl. Quorum Sensing) omogućava bakterijama da djeluju kao grupa, a ne pojedinačno. V. harveyi emitira signal putem međustanične veze, a ti signali mogu biti od krucijalne važnosti za određivanje osobina virulencije (Themptander, 2005.).
Pokazalo se da okolišni čimbenici, temperatura i salinitet vode imaju znatnu ulogu u virulenciji (Prayitno i Latchford, 1995., Mahoney i sur., 2010., Subramanian i Rosamma, 2013.).
Epizootiologija
Nepoznat je točan put bakterije tijekom infekcije ribe, a sumnja se da u ribu ulazi oralnim putem. Sposobna je prevladati želučanu barijeru, ući u crijeva i izazvati sustavno oboljenje. Izbijanju bolesti prethodi mnogostruko povećanje broja infektivnih čestica što povećava mogućnost širenja zaraze na veći broj jedinki u određenoj uzgojnoj jedinici (Austin i Zhang, 2006.).
Klinički simptomi
Bolest može zahvatiti cijeli organizam i postati sistemska. Unutarnje promjene uključuju: krvarenja i eksudat u trbušnoj šupljini, gastroenteritis, enteritis, crijevnu nekrozu, anemiju, ascites, fokalnu kongestiju jetre, blijeda područja na jetri, petehijalna krvarenja u mišićima, tekućinu u ribljem mjehuru, krvarenja po unutarnjim organima, hijalinu degeneraciju bubrežnih tubula s oštećenjem glomerula i hemosiderozom slezene (Zhang i Austin, 2000.).
Dijagnostika
Selektivni čimbenici u hranjivoj podlozi koji to omogućavaju su visoki pH i manjak magnezijevih iona potrebnih za rast većini akvatičnih bakterija; visoka koncentracija natrijevog klorida i temperatura inkubacije od 28 °C. Podloga je obogaćena celobiozom i ornitinom jer V. harveyi fermentira celobiozu i ornitin i stvara kolonije karakteristične morfologije. Međutim, ova svojstva mogu varirati među različitim izolatima vrste V. harveyi (Themptander, 2005.).
Bakterije se mogu identificirati brzim biokemijskim testovima kao što je API 20E (Buller, 2004.).
Sustavi za tipizaciju bakterija mogu detektirati raznolikosti u fenotipskoj i genotipskoj strukturi na temelju kojih se bakterije svrstavaju u određene skupine.
Identifikacija sojeva bakterije V. harveyi može predstavljati izazov jer bakterije V. harveyi, V. campbellii, V. alginolyticus, V. rotiferianus, V. parahaemolyticus, V. mytili i V. natriegens imaju visoki stupanj genotipske i fenotipske sličnosti (Sawabe i sur., 2007.).
Biokemijskim testovima je teško diferencirati V. harveyi od V. alginolyticus, međutim pomoću nekoliko biokemijskih pokazatelja moguće ih je razdvojiti (Baumann i sur., 1984.). V. harveyi daje negativnu Voges-Proskauer reakciju (VP), a ureaza je pozitivna.
Serološke se metode uspješno koriste za identifi kaciju V. harveyi u hrani i akvatičnom mediju. Od molekularnih metoda najznačajnija je lančana reakcija polimerazom (PCR). Slijedovi 16S rRNK gena, koji se kao molekularni marker rutinski koristi u detekciji i identifikaciji bakterija, su kod roda Vibrio vrlo očuvani; npr. vrste V. harveyi, V. campbellii i V. rotiferianus imaju preko 99 % identične sljedove 16S rRNK gena (Gomez-Gil i sur., 2003.). Za umnažanje 16S rRNK gena kod roda Vibrio koriste se parovi početnica VH-1 i VH-2 (Oakey i sur., 2003.) ili VHARF i VHARR (Fukui i Sawabe, 2007.), no niti jednim parom se ne postiže potpuna razlučivost svih vrsta. Uz 16s rRNK, u molekularnoj dijagnostici ove bakterije se danas često koristi i toxR gen, čiji su slijedovi također vrlo očuvani između vrsta roda Vibrio, ali sadrže i odvojive regije, potencijalno korisne za identifikaciju vrste (Cano-Gomez i sur., 2009.). Kod V. harveyi razvijena su dva para početnica za PCR toxR gena: par Vh_toxR-F i Vh_toxR-R (Conejero i Hedreyda, 2003.) koji daje lažno negativne rezultate za neke V. harveyi sojeve i par toxRF1 i toxRR1 (Pang i sur., 2006.) koji nije u potpunosti validiran. Za preciznije određivanje vrsta i za epidemiološka istraživanja, koristi se analiza slijedova više lokusa (MLSA-od engl. Multilocus Sequence Analysis). U tu svrhu razvijeni su parovi početnica za još osam referentnih gena: rpoA, recA, pyrH, gapA, mreB, ftsZ, gyrB i topA (Sawabe i sur., 2007.).
Liječenje i preventiva
Obzirom da to nije uvijek moguće, a da bi se spriječili visoki mortaliteti, ribu treba liječiti antibakterijskim tvarima.
U nekim je slučajevima jedino rješenje primjena antibakterijskih tvari u hrani, međutim, njihovo korištenje i uspješnost primjene je ograničeno, jer bolesne ribe najčešće ne uzimaju hranu (Inglis i sur., 1993.). Opažene su i razlike u osjetljivosti između i unutar sojeva ovisno o hranjivoj podlozi i koncentraciji antibakterijske tvari (Omeroglu i sur., 2009.). Osim urođene rezistencije, učestala uporaba antibakterijskih lijekova može pogodovati razvoju rezistencije te posljedičnu proliferaciju bakterije i jačanje virulencije (Thompson i sur., 2004.). Nadalje, dio lijekova primjenjenih u hrani se iz ekskrementa ili iz nekonzumirane hrane otapa te se taloži u sedimentu i predstavlja potencijalnu opasnost od razvoja antimikrobne rezistencije (Mary i sur., 2004.).
Sve unaprijed opisane činjenice ističu važnost primjene alternativnih mogućnosti liječenja poticanjem nespecifi čnog i specifi čnog imunosnog odgovora. Nakon prve primjene bakteriofaga u liječenju infekcije gofa bakterijom Lactoccoccus garviae u Japanu (Nakai i sur., 1999.), provedeni su brojni pokusi liječenja bakterijskih infekcija ovom metodom (Kalatzis i sur., 2016., 2018.). Lazado i sur. (2011.) testirali su primjenu dviju probiotskih bakterija sa svojstvom adherencije i utvrdili da one interferiraju sa svojstvom adherencije patogenih bakterija smanjujući mogućnost infekcije.
Cijepljenje je jedan od mogućih i učinkovitih načina borbe protiv bolesti te se tako sprječava pojava bolesti u akvakulturi i reduciraju gubitci prouzročeni bolešću i smanjuje uporaba antibiotika.
Produžavanje zaštitnog djelovanja može se postići dodatkom pomoćnih tvari (adjuvansa) bakterinima.
Cjepiva na bazi inaktiviranih bakterija su se pokazale jako djelotvornim, a tome pridonosi i činjenica da je većina bakterijskih cjepiva koja se koriste u akvakulturi inaktivirano (Nguyen i sur., 2017.).
Zaključci
Osim toga, potrebno je istražiti i okolišne uvjete razvoja bolesti kao i testirati najjednostavnije, ekonomski najprihvatljivije i najučinkovitije načine preventive i kontrole bolesti u uzgoju lubina i komarče.
Literatura [… prikaži]
Emerging vibriosis of Mediterranean fish caused by the bacterial species Vibrio harveyi: an overview
Ivana Giovanna ZUPIČIĆ, DVM, Assistant, Željko PAVLINEC, mag. biol. mol., Assistant, Dražen ORAIĆ, PhD, Scientific Advisor, Snježana ZRNČIĆ, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute Zagreb, Croatia
B acteria of the genus Vibrio spp. family Vibrionaceae are the most common causative agents of disease in aquatic animals. Economically, the members of the Harvey clade, with eleven closely related bacterial species, are the most important representatives of the genus Vibrio. V. harvey is commonly found in the marine environment and is a normal part of the microflora of aquatic animals. Numerous strains are described as pathogens for crustaceans and molluscs. The prevalence of infection with V. harvey is increasing and affecting more Mediterranean fish species, especially in the summer months. It is a Gram-negative, halophilic, aerobic or facultatively anaerobic bacteria. In general, it does not have zoonotic potential, though cases of human infection caused by this bacterium have been described. Some strains are highly pathogenic while others are considered opportunistic pathogens. The main virulence factors are bacterial flagellum, lytic enzymes, capsule, siderophores, hydrophobic surface antigens and its ability to adhere and infect epithelial host cells. Production of biofilm is a mechanism of antibiotic resistance, and the ability of the bacteria to extract iron from host cells is crucial for their survival.
The intracellular system allows intercellular communication between bacteria. Clinical signs are similar to other bacterial infections in fish, usually starting with lethargy and loss of appetite. V. harveyi has an innate resistance to certain antibiotics. Recently, bacteriophage therapy has been developed and is showing promising results. Vaccination is one of the most effective ways of preventing disease, reducing losses and reducing antibiotic use.
Good manufacturing practice and application of biosecurity measures are very important to minimizing the risk of introducing an infectious disease and its spread to animals within a facility. More often, infections occur with highly pathogenic emergent strains of V. harvey. Since V. harvey can be extracted from the environment, marine organisms and the digestive tract of healthy individuals, it is evident that there are different strains of the same bacterial species and it is necessary to define the differences between non-pathogenic and pathogenic strains.
Key words: V. Harveyi; bacteria; treatment; prophylaxis