Flubendazolni lijek u hrani životinjskog podrijetla

Marija Denžić Lugomer*, Nina Bilandžić, Damir Pavliček i Maja Kiš

---

Marija DENŽIĆ LUGOMER*, dipl. ing. kemije (dopisni autor, e-mail: denzic.vzk@veinst.hr), Damir PAVLIČEK, mag. chem., Maja KIŠ, mag. ing. bioproc., Veterinarski zavod Križevci, Križevci, Hrvatska; dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

▲

Uvod

---

Flubendazol (FLU), metilni ester [5-(4-fluorobenzoil)-1H-benzimidazol-2-il)] karbaminske kiseline, je benzimidazolni antihelmintik čija je kemijska struktura prikazana na slici 1. Riječ je o anthelmitiku širokog spektra djelovanja koji se primjenjuje kod liječenja pasa, mačaka, svinja i peradi. Učinkovit je kod gastrointestinalnih nematoda i oblića kod svinja te gastrointestinalnih nematoda kod peradi. Djeluje inhibicijom ili destrukcijom citoplazmatskih mikrotubula kod parazitskih crijevnih ili apsorpcijskih stanica.

Ostatci flubendazola u hrani životinjskog podrijetla mogu se pojaviti zbog pogrešnog liječenja, zbog prevelike količine unesenog lijeka u odnosu na preporučenu dozu, zbog nepoštivanja karence ili zbog toga što je životinja konzumirala kontaminiranu hranu.
Kako bi se osigurala sigurnost hrane, a time i zdravlje ljudi, u Europskoj uniji pa tako i u Hrvatskoj, doneseni su propisi o farmakološkim djelatnim tvarima, uključujući i antiparazitske lijekove iz skupine benzimidazola kojoj pripada flubendazol, i njihovoj klasifikaciji u odnosu na najveće dopuštene količine ostataka u hrani životinjskog podrijetla (EC, 2010.).

U ovom radu prikazani su literaturni podatci o ostatcima flubendazola u hrani životinjskog podrijetla. Rad obuhvaća prikaz djelovanja antiparazitskog flubendazolnog lijeka na različite životinjske vrste, metabolizam unesenog lijeka te metode određivanja ostataka.

▲

Primjena flubendazola

---

Kod liječenja životinja flubendazolom preporučuju se sljedeće doze: svinje: 5 mg/kg tjelesne mase za jednostruku primjenu i 30 mg/kg hrane deset uzastopnih dana što odgovara 1,2 mg/kg tjelesne mase po danu; perad: do 60 mg/kg hrane u trajanju od 7 uzastopnih dana što je ekvivalentno 5 mg/kg tjelesne mase po danu za brojlere i 3,6 mg/kg tjelesne mase po danu za kokoši nesilice (EMEA, 2006.). Zbog niske topivosti u vodenim sistemima (gotovo netopiv u vodi, < 10 mg/L) lijek se ne može davati parenteralno, već isključivo oralnim oblikom. Kako bi se poboljšala biodostupnost flubendazola, moguće je korištenje različitih formulacija flubendazola s kompleksirajućim agensima kao što su hidroksipropil-β-ciklodekstrin, karboksimetil celuloza ili Tween 80 koji povećavaju njegovu topivost u vodi (Ceballos i sur., 2015.). U RH flubendazol se koristi kao suspenzija za primjenu u vodi za piće pod nazivom FLIMABEND proizvođača KRKA d.d., Novo mesto, Slovenija. Navedena suspenzija koristi se za suzbijanje parazitskih invazija kokoši i pilića uzorkovanih odraslim stadijima oblića Ascaridia galli (kokošja glista), Hetarkis gallinarum (ptičja glistica) i Capillaria spp., koristi se i za suzbijanje parazitskih invazija prasadi, tovnih svinja i gravidnih krmača uzorkovanih razvojnim crijevnim stadijima i odraslim stadijima oblića Ascaris suum (svinjska glista).

U Europskoj uniji kontrola ostataka veterinarskih lijekova uključujući i lijek flubendazol provodi se u skladu sa zahtjevima Uredbe Komisije 96/23/EC (EC, 1996.) i Odluke Komisije 97/747/EC (EC, 1997.). Najviše dopuštene količine ostataka flubendazola određene su Uredbom Komisije 37/2010 o farmakološki djelatnim tvarima i njihovoj klasifikaciji u odnosu na najveće dopuštene količine rezidua farmakološki djelatnih tvari u hrani životinjskog podrijetla (EC, 2010.). Neočekivani ostatci flubendazola mogu se pojaviti u tkivima zbog pogrešnog liječenja životinjske vrste, zbog prevelike količine unesenog lijeka u odnosu na preporučenu dozu, zbog nepoštivanja karence ili zbog toga što je životinja konzumirala kontaminiranu hranu. Za flubendazolni lijek, markerski ostatak u mišiću, koži i masnom tkivu, jetri i bubregu definiran je kao zbroj flubendazola i 2-amino 1H-benzimidazol-5-il) (4-fluorofenil) metanon (FLU-HMET), dok je u jajima markerski ostatak definiran kao sam polazni lijek FLU. Najviše dopuštene količine (NDK) flubendazola s obzirom na različite vrste tkiva prikazane su u tabeli 1.

▲

Metabolizam flubendazola

---

Prilikom oralnog davanja, flubendazol se slabo absorbira iz gastrointestinalnog trakta. Apsorpcija, distribucija, metabolizam, izlučivanje kao i ostatci lijeka flubendazola proučavani su ¹⁴C obilježavanjem lijeka kod štakora, pasa, svinja i peradi. Pri tome je radioaktivno obilježen atom na drugom mjestu benzimidazolnog prstena (slika 1). Dio lijeka koji se apsorbira vrlo brzo se metabolizira što rezultira vrlo niskim koncentracijama polaznog lijeka u krvi i urinu. Glavni metaboliti u urinu svih životinjskih vrsta su rezultati karbamatne hidrolize i ketonske redukcije (slika 2). Ketoredukcija u metil[5-[(fluorofenil)hidroksimetil]-1H-benzimidazol-2-il] karbamat (FLU-RMET) pokazala se glavnim metaboličkim putem kod kokoši i purana, dok se kod svinja kao glavni metabolički put pokazala karbamatna hidroliza u (2-amino-1 H-benzimidazol-5-il)(4-fluorofenil) metanon (FLU-HMET). Oba metabolita se kasnije konvertiraju u 2-amino-α-(4-fluorofenil)-1H-benzimidazol-5-metanol (spoj 4 na slici 2).

Prilikom tretiranja svinja i peradi s flubendazolom, jetra se pokazala kao tkivo s najvećom koncentracijom ostataka lijeka i najsporijom eliminacijom. Glavni metabolit kod jetre svinje pokazao se FLU-HMET (spoj 3 na slici 2) koji je pronađen u znatno većim koncentracijama nego polazni lijek i može poslužiti kao marker prilikom određivanja ostataka lijeka flubendazola.

Metabolizam svinja proučavan je u 18 svinja raspona mase od 16,7 do 24,5 kg koje su dnevno tretirane oralno s 1,5 mg/kg ¹⁴C-flubendazolom tijekom 5 uzastopnih dana (ukupna doza 7,5 mg/kg). Navedena doza je primijenjena zbog simulacije tretiranja s 30 ppm flubendazola u hrani. Testirani pripravak radioaktivno obilježen na drugom C atomu benzimidazolnog prstena imao je specifičnu aktivnost od 9,25 μC/mg.
Trideset dana nakon primjene lijeka, izlučeno je 79% primijenjenog lijeka – 23% kroz urin, a 56% kroz feces. Glavni urinarni metabolit je rezultat karbamatne hidrolize i ketonske redukcije (spoj 4 na slici 2). U fecesu, glavni metabolit nastaje karbamatnom hidrolizom FLU-HMET (spoj 3 na slici 2). U tkivima su pronađeni isti metaboliti kao i u fecesu i urinu.
Glavni metabolit u svinjskoj jetri je spoj FLU-HMET (spoj 3 na slici 2).

Kod štakora i pasa pronađeni su isti metaboliti kao i u tkivima svinja. Jedan metabolit je pronađen jedino kod pasa, a riječ je o spoju 2-amino-α-(4-fluorofenil)-1-metil-1H-benzimidazol-5-metanol (spoj 5 na slici 2) koji je rezultat N-metilacije.

▲

Distribucija flubendazola u životinjskim tkivima

---

Studija u kojoj je proučavan metabolizam kod svinja s radioaktivno označenim ¹⁴C-flubendazolom, iskorištena je za proučavanje distribucije flubendazola u različitim tkivima (EMEA, 2006.). Šest sati nakon primjene radioaktivno označenog flubendazola, ekstrahirano je 29% ostataka u jetri, 20% u bubrezima, 10% u mišićima i 11% u masnom tkivu. Pet dana nakon primjene lijeka, u jetri je došlo do povećanja pronađenih ostataka na 52%. Slično je primijećeno i kod bubrega.
Metabolit FLU-HMET se pokazao kao glavni metabolit čineći 47%, 93,5%, 94%, odnosno 31% u odnosu na ukupne ostatke pronađene u jetri, bubregu, mišiću odnosno masnom tkivu 6 sati nakon primjene lijeka. Deset dana nakon završetka tretmana navedeni metabolit pronađen je u udjelu od 18% i 23% u jetri i bubrezima.

Distribucija flubendazola proučavana je i bez radioaktivno označenog lijeka. U jednom istraživanju trima nerastima (20 do 25 kg) davan je flubendazol u hrani u koncentraciji od 30 mg/kg pet uzastopnih dana (EMEA, 2006.). Životinje su žrtvovane nakon 16, 30 i 54 sata pri čemu je koncentracija flubendazola u plazmi, jetri, bubregu, mišiću i masnom tkivu bila manja od 0,01 μg/g. Slično je istraživanje provedeno na krmačama koje su žrtvovane sedmi dan nakon zadnjeg tretiranja s flubendazolom. Krmače su primile prosječno 0,5 mg flubendazola/kg tjelesne težine, a pronađene su sljedeće srednje koncentracije flubendazola: 0,059 μg/g u jetri, 0,067 μg/g u bubregu, 0,013 μg/g u mišiću, odnosno 0,033 μg/g u masnom tkivu sedmi dan nakon zadnje primjene lijeka. Primjenom jednostruke doze od 5 mg flubendazola/kg tjelesne težine, u obliku kapsula, na trima muškim svinjama, pronađene su koncentracije flubendazola u različitim tkivima prikazane u tabeli 2.

Kao što je vidljivo iz podataka, znatne količine ostataka flubendazola pronađene su u masnom tkivu. U istraživanju farmakokinetike različitih formulacija flubendazola kod svinja, FLU i njegov metabolit FLU-RMET pronađeni su u vrlo niskim koncentracijama u plazmi, dok je kao najzastupljeniji analit pronađen FLU-HMET (Ceballos i sur., 2015.). FLU i FLU-RMET moguće je kvantificirati u tragovima do 12, odnosno 15 sati nakon primjene lijeka.

U istraživanju distribucije flubendazola kod kokoši nesilica životinjama je davano 60 mg flubendazola/kg hrane 7 uzastopnih dana (EMEA, 2006.). Po šest životinja je žrtvovano 0, 7 i 28 dana nakon tretiranja lijekom. Srednje koncentracije flubendazola pronađene u jetri, bubrezima i mišiću odmah nakon prestanka uzimanja lijeka iznosile su 198, 173, odnosno 79 μg/kg. Jetra se pokazala kao tkivo s najvećom koncentracijom flubendazola odmah po završetku primjene lijeka. Koncentracije flubendazola u kasnijim fazama bile su ispod granice kvantifikacije koja iznosi 10 μg/kg. Istraživanjem nisu obuhvaćeni flubendazolni metaboliti. Drugo istraživanje je rađeno na kokošima nesilicama kojima je davan flubendazol u koncentraciji od 3,10 i 30 mg/kg 21 dan (Kan i sur., 1998.).
Tijekom tog perioda sakupljana su jaja te su flubendazol i njegovi metaboliti određivani u cijelom jajetu, bjelanjku i žumanjku. Hidrolizirani FLU-HMET i reducirani metabolit FLU-RMET činili su 60-65% ukupnih ostataka, a veće koncentracije ostataka pronađene su u žumanjku nego bjelanjku. Metabolit FLU-HMET pronađen je u većim koncentracijama u odnosu na reducirani metabolit FLU-RMET.
Slična studija provedena je na kokošima nesilicama kojima je davana hrana koja je sadržavala 2,5%; 5% i 10% terapeutske doze (Vandenberge i sur., 2012.). Flubendazol se pokazao kao glavni spoj u cijelom jajetu, bjelanjku i žumanjku. Najveća koncentracija oba flubendazolna metabolita pronađena je u žumanjku, zatim slijedi cijelo jaje, a najmanja koncentracija pronađena je u bjelanjku. Pri tome nisu pronađene znatnije razlike u koncentracijama između hidroliziranog FLU-HMET i reduciranog FLU-RMET metabolita (Kan i sur., 1998.). Balizs je objavio kako je koncentracija flubendazola u žumanjku pet puta veća nego u bjelanjku (Balizs, 1999.).
Distribucija flubendazolnih metabolita u ostalom tkivima kokoši proučavana je jedino sa ¹⁴C radioaktivno obilježenim flubendazolom. 48 sati nakon posljednje doze, flubendazol čini manje od 3% ukupnih ostataka u jetri i bubregu, a ostatak čine metaboliti: FLU-HMET 7,9% u jetri, odnosno 5,8% u bubregu, a FLU-RMET 5,3% u jetri, odnosno 1,4% u bubregu.

De Ruyck i suradnici proučavali su distribuciju flubendazola i njegovih metabolita FLU-HMET i FLU-RMET kod purana (De Ruyck i sur., 2001.). Purani su podijeljeni u dvije skupine kojima je davan flubendazol u obliku hrane u koncentraciji 20, odnosno 30 mg/kg.
Životinje su žrtvovane prije primjene lijeka, svakodnevno tijekom primjene lijeka i 2, 4 i 6 sati te 1, 2, 5 i 7 dana nakon prestanka primjene. Flubendazol i njegovi metaboliti analizirani su u prsnim i bedrenim mišićima te jajima.
Reducirani metabolit FLU-RMET u prsnim i bedrenim mišićima pronađen je u koncentracijama oko granice detekcije koja iznosi 0,31 μg/kg. Koncentracije hidoliziranog metabolita FLU-HMET u obje vrste mišića bila je veća nego polaznog lijeka. U bedrenom mišiću primijećene su veće koncentracije svih analita nego u prsnom mišiću. Moguće objašnjenje većih koncentracija leži u većem udjelu masti u bedrenom mišiću. Drugo moguće objašnjenje leži u činjenici da su bedreni mišiću potrebni za pokretljivost te su samim time bolje prokrvljeni.

▲

Metode određivanja ostataka flubendazola

---

Za određivanje ostataka flubendazola i njegovih metabolita objavljene su različite analitičke metode, no najčešće se koriste kromatografske metode s UV detekcijom De Ruyck i sur., 2001., Danaher i sur., 2007., Nobilis i sur., 2007., Vanenberge i sur., 2012., Ceballos i sur., 2015.). Većina tih metoda prikladna je za određivanje flubendazola i samo jednog njegovog metabolita FLU-HMET u skladu sa zahtjevima Uredbe Komisije 37/2010 (Danaher i sur., 2007.). Svega je nekoliko radova objavljeno koji opisuje metode određivanja flubendazola i njegovih FLU-RMET i FLU-HMET metabolita Kan i sur., 1998., De Ruyck i sur., 2001., Nobilis i sur., 2007., Vanenberge i sur., 2012., Ceballos i sur., 2015.). Većina kromatografskih metoda razvijene su na kolonama sa slikagelom i kemijski vezanim obrnutim fazama (C 8 i C 18 ) uz najčešće gradijentnu eluaciju uz amonijev acetatni pufer i acetonitril. Nobilis i suradnici razvili su metodu za određivanje FLU, FLU-HMET i dvije enantiomerne forme FLU-RMET koristeći kiralnu kolonu (Nobilis i sur., 2007.). Za HPLC-UV metodu određivanja FLU-RMET-a kod kokošiju objavljene su sljedeće granice kvantifikacije: 10 μg/kg za mišić i koža + masno tkivo, a 25 μg/kg za jetru i bubreg (EMEA, 2006.). Granice kvantifikacije HPLC-UV metode za flubendazol iznose 10 μg/kg za sve vrste tkiva kod kokošiju uključujući i jaja. Kod purana, granice kvantifikacije za flubendazol i metabolit FLU-RMET iznose 100 μg/kg za jetru, 75 μg/kg za bubreg i 10 μg/kg za mišić i koža + masno tkivo.

Neki objavljeni radovi koriste detekciju spektrometrijom masa uz znatno niže granice kvantifikacije od onih objavljenih za UV-detekciju De Ruyck i sur., 2001., Vanenberge i sur., 2012.). De Ruyck i suradnici opisuju metodu za određivanje flubendazola i metabolita FLU-HMET i FLU-RMET u jajima i mišićima purana s granicom kvantifikacije od 1 μg/kg osim za metabolit FLU-RMET čija granica kvantifikacije iznosi 2 μg/kg (De Ruyck i sur., 2001.).
Vandenberge i suradnici prijavili su granicu kvantifikacije od 1 μg/kg kao za flubendazol i oba njegova metabolita u kokošjim jajima (Vandenberge i sur., 2012.). Za pročišćavanje uzorka najčešće je korištena ekstrakcija tekućinama kao što su dietil eter, acetonitril, metanol ili etil acetat (Danaher i sur., 2007.). Priprema uzoraka mišića i jaja za određivanje FLU, FLU-HMET i FLU-RMET uključuje alkalizaciju uzorka otopinom natrijeva hidroksida, otopinom kalijeva karbonata ili otopinom boraksa (pH 9,3), nakon čega slijedi ekstrakcija etil acetatom. Smanjenje emulzije postiže se dodatkom natrijeva sulfata, slijedi uparavanje sakupljene organske faze u struji dušika na povišenim temperaturama (50-60 °C) ili kombinacijom vodene kupelji na 60°C i struje dušika Kan i sur., 1998., De Ruyck i sur., 2001., Vandenberge i sur., 2012.). Upareni ostatci se otapaju u HPLC eluentu i slijedi korak odmašćivanja s n-heksanom ili izooktanom prije filtiranja uzorka i nanošenja na HPLC kolonu. Neke objavljene metode uzorke pročišćavaju ekstrakcijom na čvrstoj fazi (SPE) (Danaher i sur., 2007., Ceballos i sur., 2015.).

▲

Sažetak

---

Flubendazol je benzimidazolni lijek, anthelmitik širokog spektra djelovanja koji se primjenjuje kod liječenja pasa, mačaka, svinja i peradi. Učinkovit je kod gastrointestinalnih nematoda i oblića kod svinja te gastrointestinalnih nematoda kod peradi. Glavni metaboliti u tkivima svih životinjskih vrsta su rezultati karbamatne hidrolize i ketonske redukcije. Ketoredukcija u metil[5-[(fluorofenil)hidroksimetil]-1H-benzimidazol-2-il]karbamat (FLU-RMET) pokazala se glavnim metaboličkim putem kod kokoši i purana, dok se kod svinja kao glavni metabolički put pokazala karbamatna hidroliza u (2-amino-1 H-benzimidazol-5-il) (4-fluorofenil) metanon (FLU-HMET). Ostatci polaznog lijeka flubendazola pronađeni su kao najzastupljeniji u jajima nesilica, s većom koncentracijom u žumanjku nego bjelanjku i cijelom jajetu. Danas se za određivanje ostataka flubendazola najčešće koriste kromatografske metode s UV detekcijom, a u novije vrijeme tandemna spektrometrija masa (MS/MS) zbog povećane osjetljivosti ove metode. Objavljene razvijene metode prikladne su za određivanje ostataka flubendazola u skladu s Uredbom Komisije 37/2010. Razvijeno je i nekoliko metoda za određivanje FLU i njegova dva najznačajnija metabolita FLU-HMET i FLU-RMET kako bi se doprinijelo saznanju o distribuciji navedenih analita u životinjskom tkivu čime bi se osigurala sigurnost hrane, a time i zdravlje ljudi.
Ključne riječi: benzimidazoli, flubendazol, hidrolizirani flubendazol, reducirani flubendazol

Literatura [… prikaži]

▲

Flubendazole in Foods of Animal Origin

---

Marija DENŽIĆ LUGOMER, Grad. Eng. Chem., Damir PAVLIČEK, Mag. Chem., Maja KIŠ, Mag. Ing. Bioproc., Croatian Veterinary Institute, Veterinary Department Križevci, Križevci, Croatia; Nina BILANDŽIĆ, Grad. Biotechnol. Eng., PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia

---

Flubendazole is a benzimidazole anthelminthic drug with broad-spectrum activity for the treatment of dogs, cats, pigs and poultry. It is active against gastrointestinal nematodes and lungworms in pigs, and against gastrointestinal nematodes in poultry. The major metabolites in the tissues of all animal species are the result of carbamate hydrolysis and ketone reduction. Ketoreduction to methyl [5-[(fluorophenyl) hydroxymethyl]-1 H-benzimidazol-2-yl] carbamate (FLU-RMET) has proved to be the major metabolic pathway in chickens and turkeys, while in pigs the major metabolic pathway is carbamate hydrolysis to (2-amino-1H-benzimidazol-5-yl) (4-fluorophenyl) methanone (FLU-HMET).
The major residue present in the eggs of hens was the initial drug flubendazole, with a higher concentration in egg yolk than in white or whole egg. The determination of flubendazole residues is usually performed by chromatographic methods with UV detection, and more recently, tandem mass spectroscopy (MS/MS) has been used due to its increased sensitivity. The published methods are suitable for determining residues of flubendazole pursuant to Commission Regulation 37/2010. There are few published methods for the determination of FLU and both its metabolites FLU-HMET and FLU-RMET, aiming to contribute to the knowledge on the distribution of these analytes in animal tissues, to ensure the safety of foods of animal origin, and thus human health.
Key words: Benzimidazole, Flubendazole, Hydrolyzed flubendazole, Reduced flubendazole