Genotipovi vrste Coxiella burnetii u Hrvatskoj

Ivana Račić, Sanja Duvnjak, Silvio Špičić, Maja Zdelar-Tuk, Irena Reil, Željko Cvetnić

---

dr. sc. Ivana Račić, dr. sc. Sanja Duvnjak, dr. sc. Silvio Špičić, dr. sc. Maja Zdelar-Tuk, Irena Reil, dr. vet. med., prof. dr. sc. Željko Cvetnić, Odjel za bakteriologiju i parazitologiju, Hrvatski veterinarski institut Zagreb, Hrvatska
E-mail: marjanovic@veinst.hr

Izvor: Zbornik radova KLASIČNE BAKTERIJSKE I PARAZITARNE ZOONOZE – ŠTO NAS OČEKUJE?

Sažetak

---

Vrsta Coxiella (C.) burnetii vrlo je infektivna bakterija i obvezatni unutarstanični parazit. U ljudi i životinja uzrokuje Q-groznicu koja je raširena po cijelom svijetu. U ovom su radu prvi put genotipizirani sojevi vrste C. burnetii u Republici Hrvatskoj metodom MLVA (engl. Multi Locus VNTR Analysis, Variable Number of Tandem Repeats) koja se u svijetu tek uvodi kao metoda za genotipizaciju C. burnetii. Metoda je primijenjena na 49 uzoraka podrijetlom od domaćih životinja: 32 uzorka u potpunosti je tipizirano, a 31 svrstan je u jedan od 13 dobivenih genotipova. Dva genotipa srodnija su s genotipovima u svijetu nego s hrvatskim genotipovima, a karakteristični su za kontinentalni dio Hrvatske. Ostali genotipovi srodniji su međusobno nego sa stranim genotipovima, a karakteristični su za obalnu Hrvatsku. Metoda MLVA uvedena je kao rutinski dijagnostički postupak čime je omogućeno utvrđivanje izvora i puteva širenja infekcije što će pridonijeti kontroli i suzbijanju bolesti u domaćih životinja koje su ujedno primarni izvor zaraze za ljude.

---

Ključne riječi: Coxiella burnetii; MLVA; genotipovi; Republika Hrvatska

Uvod

---

Coxiella (C.) burnetii iznimno je infektivna bakterija koja u ljudi i životinja izaziva Q-groznicu. Ljudi i životinje najčešće se zaraze udisanjem aerosola i prašine zaražene bakterijom. C. burnetii izlučuje se u mlijeku, vaginalnom iscjetku, fecesu, a pogotovo u posteljici zaražene životinje te samom plodu. ^5,2 Posteljica zaraženih životinja može sadržavati i do 10⁹ bakterija po gramu.²
U Republici Hrvatskoj godišnje je u razdoblju od 2000. do 2012. prijavljeno od 20 do 70 slučajeva Q-groznice, a najviše 206 slučajeva u 2003. te 104 slučaja u 2004. godini.³
Ovim istraživanjem identificirali smo u Hrvatskoj prisutne genotipove sojeva C. burnetii izdvojenih iz terenskih uzoraka ljudi i domaćih životinja te ih usporedili s dostupnim genotipovima iz raznih dijelova svijeta. ⁷ Informacije dobivene ovim istraživanjem mogle bi u budućnosti predvidjeti pojavu zaraza te pojasniti kako se hrvatski sojevi odnose prema stranim sojevima. Također, na taj način nadamo se pridonijeti i razvoju MLVA tehnike kao standardne metode genotipizacije te bakterije.

Materijal i metode

---

U razdoblju od 2004. do 2012. izdvojili smo DNA iz 3261 uzorka različitih tkiva ljudi i životinja koristeći DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) i QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Svi uzorci provjereni su na prisutnost DNA C. burnetii konvencionalnim PCR-om. ⁸ (tablica 1).

Od uzoraka DNA koji su bili pozitivni 82 je genotipizirano korištenjem MLVA. Tehnika obuhvaća 17 različitih lokusa. ¹ Veličina fragmenata DNA određena je kapilarnom elektroforezom pomoću uređaja QIAxcel (Qiagen) ili klasičnom gel-elektroforezom. Na osnovi velične DNA fragmenata određen je broj ponavljanja za svaki lokus.
Rezultate tipiziranja, u obliku 17-članog koda, analizirali smo UPGMA algoritmom u Bionumerics 7.1 software-u (Applied Maths, Belgium). Izračunali smo i Hunter-Gaston indeks razmolikosti (HGDI) radi procjenjivanja diskriminacijskih mogućnosti metode MLVA. ⁴

Rezultati

---

Izolirali smo DNA iz 3261 uzorka tkiva ljudi i životinja te smo u njih 335 (10,3 %) uspjeli identificirati DNA C. burnetii pomoću konvencionalnog PCR-a. ⁴ Od tih 335 uzoraka, 82 smo izabrali za genotipizaciju. Od izabranih uzoraka, samo 32 uzorka uspjeli smo genotipizirati na najmanje 16 lokusa. Od toga, 26 uzoraka uspjeli smo tipizirati na svih 17 lokusa. Šest uzoraka nismo uspjeli genotipizirati na lokusu ms23. Odredili smo 13 različitih genotipova. Rasprostranjenost tih genotipova u Hrvatskoj prikazana je na slici 1.
Procijenili smo mogućnost diskriminacije svih lokusa u eksperimantalnim uvjetima računajući HGDI. ³

Zaključak

---

Jednostavnost i brzina kojom Coxiella burnetii širi zarazu među ljudima i životinjama čini brzu, jasnu i jednoznačnu genotipizaciju vitalnu za monitoring i kontrolu bolesti i uzročnika. Identificirali smo 13 novih genotipova (CbCRO01 – CbCRO13), sugerirajući da je globalna raznolikost C. burnetii vrlo podcijenjena.

Genotip CbCRO01 izdvojen je iz najstarijeg uzorka u ožujku 2004. Od svih 13 identificiranih genotipova, CbCRO01 je nasličniji CbCRO02. Ta dva genotipa od ostalih se razlikuju u 10 od 11 lokusa, ukazujući na nesrodnost s ostalim hrvatskim genotipovima. Nalaze se samo u kontinentalnom području RH, posebice u Osječko-baranjskoj, Koprivničko-križevačkoj, Vukovarsko-srijemskoj i Bjelovarsko-bilogorskoj županiji.

Genotipovi CbCRO04, CbCRO08, CbCRO09, CbCRO10 i CbCRO12 razlikuju se samo na lokusu ms26. Svih pet genotipova pojavljuje se isključivo u priobalnom dijelu RH, osim CbCRO12, koji se pojavljuje i u kontinentalnom dijelu (Karlovačka županija). Postoji mogućnost da jedan genotip, CbCRO09, prelazi s ovaca na goveda. Identificirali smo ga 2000. na farmi koza u Splitsko-dalmatinskoj županiji te opet 2013. na farmi goveda u Bjelovarsko-bilogorskoj županiji. Pretpostavljamo da su životinje nezakonito prevezene s jedne farme na drugu te da je uzročnik prešao s koza na goveda.

Genotipovi CbCRO04, CbCRO08, CbCRO09, CbCRO10 i CbCRO12 razlikuju se na 1 ili 2 lokusa od genotipova CbCRO07, CbCRO03, CbCRO05 i CbCRO11 dok se od CbCRO06 i CbCRO13 razlikuju na tri lokusa. Tih 11 genotipova pojavljuju se u priobalnom dijelu RH, osim CbCRO05, koji je prisutan u kontinentalnom području (Zagrebačka županija).

U Šibensko-kninskoj županiji identificirali smo najviše različitih C. burnetii genotipova: CbCRO03, CbCRO04, CbCRO09, CbCRO10 i CbCRO11, dok smo u drugim županijama identificirali najviše tri različita genotipa. Vrijednosti indeksa raznolikosti (HGDI) izračunali smo za svih 17 lokusa te je vrijednost vrlo visoka: 0.923. Uspoređujući hrvatske genotipove s dostupnim genotipovima iz svih krajeva svijeta primijetili smo unikatnost hrvatskih sojeva. Genotipovi CbCRO02 i CbCRO01 najsrodniji su stranim genotipovima. Oni nisu srodni niti jednom drugom hrvatskom genotipu te se zadržavaju isključivo u kontinentalnom dijelu Hrvatske. Svi drugi identificirani genotipovi srodniji su međusobno nego sa stranim genotipovima. Pretpostavljamo da su tih 11 genotipova endemični za Hrvatsku.
Daljnja istraživanja nužna su kako bi se utvrdila moguća prisutnost hrvatskih genotipova u drugim zemljama za koje sada ne raspolažemo s podacima. Svakako bi trebalo doraditi trenutačno korištenu MLVA shemu za tipizaciju Coxiella burnetii kako bi se povećala robustnost iste za različite vrste i kvalitetu uzoraka.

Literatura
1. Arricau-Bouvery, N., Y. Hauck, A. Bejaoui, D. Frangoulidis, C. C. Bodier, A. Souriau, H. Meyer, H. Neubauer, A. Rodolakis, G. Vergnaud (2006): Molecular characterization of Coxiella burnetii isolates by infrequent restriction site-PCR and MLVA typing. BMC Microbiol. 6, 38.
2. Arricau-Bouvery, N., A. Rodolakis (2005): Is Q fever an emerging or re-emerging zoonosis? Vet. Res. 36, 327-349.
3. Croatian National Institute of Public Health, 2012. Croatian Health Service Yearbook 2012. p. 188.
4. Hunter, P. R., M. A. Gaston (1988): Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J Clin Microbiol 26, 2465-2466.
5. Maurin, M., D. Raoult (1999): Q fever. Clin. Microbiol. Rev. 12, 518-553.
6. MLVA bank for Microbes Genotyping on the internet page http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/index.php (accessed on February, 2nd 2014)
7. Račić, I., S. Špičić, A. Galov, S. Duvnjak, M. Zdelar-Tuk, A. Vujnović, B. Habrun, Ž. Cvetnić (2014): Identification of Coxiella burnetii genotypes in Croatia using multi-locus VNTR analysis. Vet. Microbiol. 173, 340-347.
8. Willems, H., D. Thiele, R. Frölich-Ritter, H. Krauss (1994): Detection of Coxiella burnetii in cow’s milk using the polymerase chain reaction (PCR). Zentralbl. Veterinarmed B 41, 580-587.

---