Hepatitis E – jesmo li ugroženi?

Lorena Jemeršić, Besi Roić, Jelena Balatinec i Tomislav Keros

Dr. sc. Lorena JEMERŠIĆ, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, dr. sc. Besi ROIĆ, dr. med. vet., viša znanstvena suradnica, Jelena BALATINEC, dipl. ing. mol. biol., dr. sc. Tomislav KEROS, dr. med. vet., Hrvatski veterinarski institut, Zagreb

Uvod

---

Hepatitis E virus (HEV) je jedan od najučestalijih uzročnika akutne upale jetara u ljudi. Smrtnost nakon infekcije može iznositi 1-4%, dok u trudnica i imunosupresivnih osoba može biti i znatno viša (Hussaini i sur., 1997., Le Coutre i sur., 2009.).
S javno-zdravstvenog gledišta, hep­atitis E je naročito raširen u državama u razvoju gdje se javlja endemski (države Azije, Afrike i Središnje Amerike-Mek­siko), a do njegovog naglog širenja najčešće dolazi fekalno-oralnim prijen­osom i to putem kontaminirane vode za piće. Tijekom 1997. godine u SAD su prvi puta opisani i sporadični slučajevi bolesti, kada je sam izvor infekcije os­tao nepoznatim (Meng i sur., 1997.b).
Nakon izdvajanja HEV iz svinja (Clayson i sur., 1995., Meng i sur., 1997.b), pojavila se sumnja da su upra­vo životinje mogući potencijalni izvori i biološki rezervoari virusa hepatitisa E (Tei i sur., 2003.).
Do danas je HEV, osim u domaćih i divljih svinja izdvojen iz srna, jelena, štakora, pasa, mačaka, mungosa, gove­da, ovaca, koza, nekih vrsta peradi, kunića i konja (Nishizawa i sur., 2003., Nishizawa i sur., 2005., Nakamura i sur., 2006., Johne i sur., 2008., Zhang i sur., 2008., Johne i sur., 2009., Schielke i sur. 2009., Tomiyana i sur., 2009., Zhao i sur., 2009.).
Usprkos relativno visokoj prevalen­ciji hepatitisa E utvrđenoj u životinja, do danas postoje samo dva slučaja pojave hepatitisa E u ljudi koji se sa sigurnošću mogu povezati s kontaminiranom hranom životinjskog podrijetla kao izvo­rom infekcije (Li i sur., 2005.). Suprotno tomu, prevalencija hepatitisa E u ljudi koji dolaze u izravan kontakt s domaćim svinjama značajno je viša nego u ljudi koji
ne dolaze u kontakt sa svinjama (Drobe­niuc i sur., 2001.). Viša prevalencija utvr­đena je i u veterinara pa i onih koji nisu iz­ravno u kontaktu sa svinjama, u odnosu na pretraženu krv donora drugih struka (Meng i sur., 2002.).

Etiologija hepatitisa E

---

Uzročnik hepatitisa E je RNK vi­rus, koji pripada rodu Hepevirus, poro­dici Hepeviridae (Emerson i sur., 2004). Prvotno se svrstavao u porodicu Caliciviridae, ali je naknadnim upoznava­njem njegovih replikacijskih osobitosti izdvojen u zasebnu obitelj (Tam i sur., 1991.). Virus je ikozaedralnog oblika i veličine od 32 do 34 nm. Unutar vi­rusne kapside nalazi se jednolančana molekula RNK pozitivnog naboja, duljine oko 7,2 kb, s ne-prepisujućim 5’ i poliadeniliranim 3’ krajem molekule.
Pretpostavka je da oba kraja molekule RNK sudjeluju u regulaciji prepisiva­nja i umnožavanja virusa (Tam i sur., 1991.). Između ne-prepisujućih krajeva molekule nalaze se tri zasebna otvorena okvira čitanja (engl. Open reading frame ili ORF) ili kodirajuće regije.
ORF1 zauzima dvije trećine RNK molekule i najvjerojatnije je odgovaran za kodiranje za nestrukturni polipro­tein koji se kasnije cijepa na manje ne­strukturne proteine virusa poput metil­transferaze, cistein proteaze, helikaze i RNK zavisne RNK polimeraze (Koonin i sur., 1992.). ORF1 je vrlo postojan i nalazi se bliže 5’ kraju RNK molekule. ORF2 i ORF3 nastaju prepiskom iz sub-genomske RNK (Graff i sur., 2006.). ORF2 je odgovoran za kodi­ranje kapsidnog proteina, dok ORF3 dijelom preklapa ORF2 i kodira fosfo­protein veličine 123 aminokiselina, a koji sudjeluje u virusnoj morfogenezi.
ORF2 i ORF3 su smješteni bliže 3’ ne-prepisujućem kraju molekule RNK. Usprkos poznavanju morfologije HEV, do danas nije u cijelosti poznat ciklus njegovog umnožavanja, niti su utvrđeni stanični receptori za virus, a nisu poznati ni nositelji svojstava nje­gove virulencije (Pavio i sur., 2010.).
Pretpostavlja se da nakon ulaska viru­sa u stanicu i oslobađanja RNK dolazi do aktiviranja ORF1 i prepiske poliproteina te nastanka nestrukturnih proteina, koji sudjeluju u sintezi genomske i sub-ge­nomske RNK. Zbog nakupine replikaci­jskih čimbenika u blizini endoplazmat­skog retikuluma, utvrđenih nakon in vitro umnožavanja virusa, smatra se da je upravo on ključan za umnožavanje virusnih čestica (Graff i sur., 2006.). HEV ne pokazuje citopatski učinak in vitro.
Pretpostavlja se da je osnova njegove pa­togeneze in vivo posljedica burnog imu­nosnog odziva organizma na njegovo prisustvo (Tam i sur., 1996.).
Danas su poznate četiri osnovne genetske skupine HEV koje se javljaju u sisavaca (genotipovi 1, 2, 3 i 4), pred­stavljaju ih: izolat izdvojen u Burmi, izolat izdvojen u Meksiku, izolat iz SAD i izolat iz Kine (Lu i sur., 2006.) te jedna zasebna skupina koju čine virusi izdvojeni iz ptica (Okamoto, 2007.).
Genotipovi 1 i 2 su izdvojeni isključivo iz ljudi i uzročnici su infek­cija epidemijskih razmjera u zemalja u razvoju gdje se hepatitis E javlja en­demski. Najčešći izvor širenja infekcije je pri tom kontaminirana voda za piće ili kontaminirani spremnici s vodom za piće (Lu i sur., 2006.), dok se prijenos s čovjeka na čovjeka javlja iznimno ri­jetko (Aggarwall i Naik, 1994.).
Sa stajališta patogeneze, čini se da su izolati genetskih skupina 1 i 2 jače patogeni od izolata skupina 3 i 4. To potvrđuje i znatno blaži oblik bolesti u trudnica inficiranih HEV genotipa 3 u odnosu na infekciju genotipovima 1 i 2 (Andersson i sur., 2008.). Genotipovi 3 i 4 su izdvojeni iz ljudi i različitih vrsta sisavaca te su najčešće uzrokom sporadičnih slučajeva hepati­tisa E. Genotip 3 je izdvojen s područja Europe, SAD i Japana, dok je genotip 4 ponajprije svojstven za Aziju (Lu i sur., 2006.), premda su zabilježeni sporadični slučajevi infekcije tipom 4 i u Europi (Witchman i sur., 2008., Foge­da i sur., 2009.). Nedavno su opisani i izolati HEV izdvojeni iz kunića u Kini koji se pokazao najsrodnijim genotipu 3 (Zhao i sur., 2009.) i izolat izdvojen iz štakora koji nije još klasificiran (Johne i sur., 2009.).
Opisan je i ptičji HEV za kojeg se smatra da je uzrokom upala jetara uz povećanje slezene (hepatitis-splenome­galskim sindromom) u pilića. Nukleo­tidni odsječci ptičjih izolata HEV, ko­jih je do danas poznato tri skupine, su podudarni svega u 50% s ostalim poznatim genotipovima HEV, stoga oni, najvjerojatnije predstavljaju novi rod un­utar porodice Hepeviridae (Meng, 2010.).

Dijagnostika hepatitisa E

---

U ljudi se hepatitis E javlja u ina­parentnom i akutnom obliku. Akutni tijek infekcije mogu pratiti blagi zna­kovi bolesti, ali ponekad i vrlo teški znakovi koji dovode do potpunog za­tajenja rada jetara i smrti. U pravilu se hepatitis E ne javlja u kroničnom tijeku, mada postoje opisi kroničnog hepatitisa E u imunosupresivnih osoba (Purcell i Emerson, 2008.). Nakon isključivanja os­talih virusnih uzročnika hepatitisa u lju­di te nekih autoimunih bolesti, uz nalaz deseterostrukog povećanja vrijednosti jetrenih enzima, naročito alanin amino­transferaze (ALT), sama se dijagnoza može postaviti na temelju specifičnih laboratorijskih pretraga.
Premda HEV ne dovodi do po­jave znakova bolesti u životinja, one, a naročito svinje, kao rezervoari virusa predstavljaju vrlo značajnu kariku u daljnjem širenju infekcije. Halbur (2001.) i Williams (2001.) su nakon pokusne in­fekcije prasadi u dobi od dva do četiri tje­dna s izolatima HEV izdvojenih iz ljudi i svinja dokazali prisustvo protutijela za HEV, bez znakova bolesti i uz normalne vrijednosti jetrenih proba. Usprkos tomu, virus je dokazan u fecesu inficiranih svinja i tri do pet tjedana nakon infekcije (Halbur, 2001.). Pokusna infekcija kunića genotipovima 1 i 4 virusa hepatitisa E dala je slične rezultate. Premda je nakon infekcije nastupila viremija i došlo je do izlučivanja virusa putem fecesa praćeno povišenjem vrijednosti jetrenih proba, klinička slika bolesti je izostala, osim u kunića koji su primili vrlo visoku infek­tivnu dozu vrlo patogenog soja GDC54-18 (Ma i sur., 2010.).
Stoga su specifične laboratorijske pretrage nezamjenjivi alat za utvrđivanje prevalencije HEV u životinja, ali i poten­cijalnog prisustva virusa u prehramben­om lancu (Feagins i sur., 2008.a). Usprkos osebujnim genetskim vari­jacijama, HEV je antigeno postojan te je do danas utvrđen samo jedan serotip (Meng, 2006.). Ta spoznaja omogućuje dokazivanje HEV specifičnih protu­tijela u različitih vrsta životinja komer­cijalnim imunoenzimnim kompletima koji se rabe u dijagnostici hepatitisa E u ljudi, uz jednostavnu prilagodbu (Engle i sur., 2002.). Osim imunoenzim­nog testa za dokazivanje specifičnih IgG i/ili IgM protu-HEV protutijela, za sigurno dokazivanje HEV danas se rabe standardni i kvantitativni PCR protokoli (Huang i sur., 2002., Jothi­kumar i sur., 2006.). Opisan je i visokoosjetljiv i specifičan RT-PCR protokol koji raspoznaje različite genotipove HEV, uključujući one koje se javljaju u sisavaca, peradi, a i štakora (Huang i sur., 2002.).

Prevencija i liječenje hepatitisa E

---

S obzirom da se do danas ne poznaju svi putevi širenja HEV, ne postoje ni sigurne mjere za prevenciju njegovog pojavljivanja.
Nespecifične mjere, poput povećanja sanitarnih standarda sa svrhom sma­njivanja rizika kontaminacije vode za piće, učinkovite su u zemalja u razvoju, gdje se HEV javlja endemski. U razvijenih zemalja smatra se da je najvažniji put unosa virusa u orga­nizam putem kontaminiranih, termički nedovoljno obrađenih namirnica životinjskog podrijetla. RNK virusa je izdvojena i iz jetara svinja namijenjenih prodaji i javnoj potrošnji (Feagins i sur., 2008.a, McCreary i sur., 2008.). Pokusna termička obrada kontaminiranih jetara pri 191 °C pet minuta, kao i kuhanje 5 minuta, je inaktiviralo virus. Međutim, temperatura od 56 °C kroz jedan sat nije uništila rezidualnu virusnu RNK u jetrima (Feagins i sur., 2008.b). Stoga bi trebalo upozoriti ljude o mogućem rizi­ku od infekcije. To bi bilo od naročitog značenja za one od posebne osjetljivo­ sti spram infekcije, kao što su trudnice, ljudi s težim oštećenjem jetara, imuno­supresivne osobe, primatelji transplati­ranih organa i oni koji dolaze u izravni kontakt s potencijalnim rezervoarima virusa, u koju skupinu spadaju veterinari i uzgajivači stoke.
Infekcija virusom hepatitisa E mo­gla bi se prevenirati i cijepljenjem osjetljivih skupina ljudi ili onih koji putuju u krajeve gdje se bolest javlja endemski (Jameel, 1999.). Do danas ne postoji komercijalno dostupno cjepivo protiv HEV. Međutim, pokusno rekom­binantno cjepivo temeljeno na kapsid­nom proteinu virusa je u posljednjoj fazi istraživanja (Amini-Bavil-Olyaee i sur., 2009.). Preliminarni rezultati uka­zuju na njegovu visoku učinkovitost (88,5% nakon primovakcinacije i 95,5% nakon ponovljene doze). S obzirom na izdvajanje novih izolata virusa, ista bi se trebala istražiti i na učinkovitost pri infekciji s novim izolatima (Emerson i Purcell, 2001.).
Hepatitis E se liječi simptomatski.
Preliminarna in vitro ispitivanja Jameela iz 1999. godine pokazuju da su ribavirin i interferon alfa umanjili mogućnost rep­likacije virusa u staničnim kulturama, međutim, do danas na tržištu ne postoji učinkovit lijek protiv hepatitisa E.

Istraživanje pojavnosti virusa hepatitisa E u životinja u Republici Hrvatskoj

U sklopu projekta “Primjena ge­netičkih analiza u veterinarskoj medi­cini” (048-0481186-1183), tijekom 2009. godine je pri Virološkom Odjelu Hrvatskog veterinarskog instituta, Laboratoriju za dijagnostiku klasične svinjske kuge, molekularnu virologiju i genetiku započelo istraživanje preva­lencije virusa hepatitisa E u domaćih i divljih životinja.

Materijali i metode

U ovom radu prikazujemo rezultate pretraživanja 355 uzoraka podrijetlom od domaćih svinja iz velikih farmskih uzgoja i iz malih dvorišnih uzgoja, div­ljih svinja te srna i jelena (tablica 1.) na prisutnost RNK virusa hepatitisa E. Od svih pretraženih životinja za­prim­ljena je krv, a u nekih životinja i slezena te jetra. Svi su uzorci pretraženi umreženom lančanom reakcijom polimerazom (Huang i sur., 2002.) uz pre­thodnu reverznu transkripciju.

Priprema uzoraka i izolacija virusne RNK

U istraživanju smo za dokazivanje HEV-a pretražili uzorke krvi i organa domaćih i divljih svinja te srna i jelena. Uzorke pune krvi smo odvajali od stijenki epruveta sterilnom špatulom i nakon toga centrifugirali 10-20 minuta pri 1500 do 3000 rpm-a. Nakon izdva­janja seruma, prebacili smo ih u nove epruvete u količini od 300 do 1000 μL. Uzorke organa (slezena, jetra) usit­njavali smo izrezivanjem sterilnim škaricama te homogenizrali u fiziološkoj otopini. Homogenizirano tkivo smo prenijeli u sterilne epruvete i centrifugi­rali 10 – 20 minuta pri 1500 do 3000 rpm-a. Nadtaloge smo prebacili u nove epru­vete u količini od 300-1000 μL.
Virusnu RNK izolirali smo pre­ma protokolu kompleta QIAamp Viral RNA Mini (tvrtke Qiagen, Hilden, Njemačka).

Reverzna transkripcija

Postupak reverzne transkripcije obavili smo kompletom za reverznu transkripciju SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, Carlsband, SAD) pomoću uređaja Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, SAD). Postupak smo proveli u dvije faze. U prvoj smo fazi priredili reakcij­sku otopinu konačnog volumena 11 μL koja je sadržavala 6 μL RNK izolata, 50 ng/μL nasumičnih početnica i 10 mM dNTP, a inkubacija je trajala 5 minuta pri 65 °C nakon čega smo radnu otopinu stavili na led. U drugoj smo fazi reakcijskoj smjesi dodali 50 mM MgCl2, 0,1 M DTT, Rnase-OUT i SuperScript III Reverse Transcriptase te smo inkubirali 10 minuta pri 25 °C, 50 minuta pri 50 °C i 5 minuta pri 85 °C. Dobivenu komple­mentarnu molekulu DNK (cDNK) smo pohranili pri +4 °C.

Umrežena lančana reakcija polimerazom (engl. nested PCR)

Postojane regije unutar ORF2 dijela genoma virusa umnožili smo nizom lančanih reakcija polimerazom (PCR). Nakon izravnog PCR-a, korištenjem para početnica 3156N/3157N (Huang i sur., 2002.), umnoženi odsječak bio je veličine 731 bp, ali u tako niskom ti­tru da nije bio vidljiv elektroforetskom analizom u 1,5%-tnom agaroznom gelu. Zbog toga smo proizvod izravnog PCR-a koristili za umreženi PCR. Na­kon umreženog PCR-a, korištenjem para početnica 3158N/3159N (Huang i sur., 2002.) umnoženi odsječak je veličine 348 bp. Šest μL cDNK korišteno je za kalup u izravnom PCR-u u reakcij­skoj smjesi ukupnog volumena 50 μL, dok je 6 μL proizvoda izravnog PCR-a korišteno za kalup u umreženom PCR-u u reakcijskoj smjesi ukupnog volu­mena 50 μL.
Toplinski ciklusi koje smo rabili pomoću uređaja Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, SAD) bili su: početna denatu­racija pri 95 °C tijekom 9 minuta, 39 ciklusa umnožavanja koji uključuju denaturaciju pri 94 °C tijekom 1 min­ute, sparivanje početnica i kalupa pri 42 °C tijekom 1 minute i produljenje lanca pri 72 °C tijekom 2 minute te naposljet­ku završno produljenje lanca pri 72 °C tijekom 7 minuta (Huang i sur., 2002.).

Analiza PCR-produkata elektroforezom u gelu agaroze

Elektroforezu smo proveli tijekom 60 minuta pri sobnoj temperaturi uz primjenu 60-70 V i 90 mA, u 1,5%-tnom gelu agaroze priređenom u 1xTBE puferu. Isti pufer koristili smo kao elektroforetski pufer. U jažice smo unijeli 6 μL PCR proizvoda kojem smo dodali 1 μL obojenog pufera za elektro­forezu.
Za očitavanje rezultata rabili smo ljestvicu DNK od po 100 bp (DNA Lad­der marker), a rezultate smo očitali pomoću uređaja UV-transiluminatora (Vilber Lourmat, Torcy, Francuska).

Rezultati istraživanja

---

Pozitivni rezultati su smatrani oni­ ma kod kojih je nakon elektroforeze u 1,5% gelu agaroze došlo do pojave linije u visini 348 bp (slika 2.). Pozitivna kontrola je predstavljala sigurno pozi­tivni uzorak cDNK virusa hepatitisa E.

Rezultati pretraživanja uzoraka domaćih svinja iz velikih uzgoja prikupljeni na farmi A i B

Rezultati pretraživanja 140 domaćih svinja s farmi A i B ukazuju na vrlo visoku prevalenciju (53-70%) virusne RNK u prasadi do četiri tjedana starosti i odraslih svinja s farme A, odnosno RNK virusa hepatitisa E je nađena u svih pretraženih dobnih kategorija svinja s farme B (tablica 2.).

Rezultati pretraživanja domaćih svinja iz dvorišnih uzgoja

Pretraživanja 144 svinja podrijet­lom iz dvorišnih uzgoja iz različitih županija pokazala su pozitivan rezultat na prisustvo HEV, neovisno o dobnoj kategoriji, ali s najvećom učestalošću pojave pozitivnog rezultata u tovlje­nika (75% od svih pozitivnih uzoraka).
Najviše je pozitivnih svinja u odnosu na pretražene utvrđeno u Sisačko-moslavačkoj županiji. U Splitsko-dalmatinskoj i Krapinsko-zagorskoj županiji nije utvrđena RNK virusa hep­atitis E niti u jednog od pretraživanih uzoraka svinja (tablica 3.).

Rezultati pretraživanja uzoraka podrijetlom od divljih svinja

RNK virusa hepatitisa E je izdvo­jena iz divljih svinja u Brodsko-posav­skoj, Sisačko-moslavačkoj i Virovitičko-podravskoj županiji. Prevalencija je iznosila 28,6 do 31,3%. Najviše pozi­tivnih rezultata je dobiveno u divljih svinja starosti do godine dana (66,6%) i to neovisno o spolu divljih svinja. U pretraženih divljih svinja s područja Osječko-baranjske, Koprivničko-križevačke, Krapinsko-zagorske i Zagrebačke županije nije utvrđena RNK virusa hepatitisa E (tablica 4.).

Rezultati pretraživanja na prisustvo RNK virusa hepatitisa E u uzoraka podrijetlom od srna i jelena

Svi pretraženi uzorci podrijetlom od srna i jelena su dali negativan rezultat na prisutnost RNK virusa hepa­titisa E nakon uzastopnog ponavljanja postupka.

Rasprava

---

Hepatitis E je primarno javno-zdravstveni problem u zemalja u razvoju. U novije je vrijeme njegova sporadična pojavnost zabilježena i u razvijenih zemalja diljem svijeta. S obzi­rom da je virus izdvojen i iz domaćih i divljih životinja, opravdano je pitanje njihovog značenja u prijenosu infekcije.
Do danas je utvrđena vrlo visoka serološka prevalencija virusa hepatitisa E u svinja s različitih kontinenata. Pod pretpostavkom da je i jedan pozitivan nalaz dostatan da se uzgoj proglasi pozitivnim, rezultati ukazuju da je u 100% uzgoja u SAD dokazana seroprevalen­cija (Meng i sur., 1997.b), 90% uzgoja u Novom Zelandu (Garkavenko i sur., 2001.), 46% u uzgoja u Laosu, 100% Meksiku (Pavio i sur., 2010.) i 98% uzgoja u Španjolskoj (Fogeda i sur., 2009.).
Međutim, dokaz protutijela ne daje dostatno epidemioloških informacija o povezanosti infekcija HEV unutar i između vrsti. Stoga u našem radu opisujemo rezultate dokazivanja RNK virusa hepatitisa E u uzorcima podrije­tlom od domaćih svinja držanih na velikim farmama i u malim dvorišnim uzgojima, divljih svinja te srna i jelena.
Premda je ciljni organ za umno­žavanje HEV jetra, RNK virusa je izdvojena iz kolona, limfnih čvorova i slezene pokusno inficiranih svinja 20. do 27. dana nakon inokulacije vi­rusa, tijekom trajanja viremije. RNK je nađena i u želudcu, tankom crijevu, bubrezima, žlijezdama slinovnicama, tonzilama i plućima te u mišićima 14. dana nakon pokusne infekcije (Wil­liams i sur., 2001.). Virus se izlučuje fe­cesom u vanjsku sredinu i tjednima na­kon inokulacije (Halbur, 2001.). Premda je sakupljanje fecesa jednostavan način uzorkovanja na svinjogojskim farmama, u našem smo istraživanju pretraživali slezene, krv i jetre domaćih i divljih svinja, s obzirom da feces sadrži enzime koji mogu umanjiti os­jetljivost PCR reakcije (Wilson, 1999.) i zbog činjenice da se znatno smanjuje izlučivanje virusa fecesom nakon petog mjeseca starosti svinja (Pavio i sur., 2010.). HEV se u svinja najlakše prenosi fekalno-oralnim putem, odnosno kon­taktom (Bouwknegt i sur., 2009.). Rezultati našeg istraživanja ukazuju na visoku virusnu prevalenciju (srednje vrijednosti 37,5%) nađenu u domaćih svinja, neovisno o načinu držanja. Nalaz RNK virusa u vrlo visokom postotku (70%) u odraslih životinja s farme A, uz izostanak nalaza RNK u tov­ljenika i starije prasadi (u dobi od šest do osam tjedana), u kojih je uobičajeno naći virus u najvećem postotku, jer infekcija najčešće nastaje do 150. dana starosti svinja (Kunio i Nishiura, 2007.), može ukazivati na svježu infekciju virusom hepatitisa E. Nadalje, krmače inficirane virusom hepatitisa E tvore protutijela nakon šestog do osmog tjedna od in­fekcije (Meng i sur., 1997.a), koje putem kolostruma prenose na prasad. Pasivna imunost nestaje nakon osam do deset tjedana starosti, dok aktivni imunitet i serokonverzija nastaju između 14. i 17. tjedna starosti svinja uz najviši postotak viremičnih životinja 15. tjedna starosti (De Deus i sur., 2008.). Naš nalaz RNK HEV u prasadi do četvrtoga tjedna sta­rosti s farme A može uputiti na mišljenje da prasad nije kolostrumom primila protutijela od krmača u dovoljnoj mjeri. To bi ukazivalo da je infekcija u krmača bila blaga ili je nastupila unutar osam tje­dana od uzorkovanja materijala. S druge strane, nalaz s farme B odgovara infek­ciji koja je dulje prisutna u uzgoju, gdje su pozitivan rezultat dale sve pretražene dobne kategorije, ali u nešto manjem postotku (srednja vrijednost iznosi 26%), nego onom nađenom na farmi A. Nađene virusne prevalencije na farmi A i B su niže od one opisane u Danskoj, koja iznosi do 55% (Rutjes i sur., 2007.), dok su slični podatci našima dobive­ni pretraživanjem svinja s područja Mađarske (Reuter i sur., 2009.).
Rezultati naših pretraživanja doma­ćih svinja iz manjih, dvorišnih uzgoja ukazuju na proširenost hepatitisa E u Bjelovarsko-bilogorskoj, Brodsko-posavskoj, Koprivničko-križevačkoj, Sisačko-moslavačkoj i Vukovarsko-sri­jemskoj županiji. Srednja vrijednost po­jave iznosi 26,4%, s najvišom virusnom prevalencijom zabilježenom u Sisačko-moslavačkoj županiji (39,3%). Virus je najčešće nađen u tovljenika, što od­govara prethodnim opisima dinamike infekcije virusom hepatitisa E (Kunio i Nishiura, 2007., Pavio i sur., 2010.).
RNK virusa hepatitisa E nije nađena u svinja s područja Krapinsko-zagorske i Splitsko-dalmatinske županije.
U divljih je svinja infekcija HEV utvrđena u 30,1% (srednja vrijednost) u tri od sedam pretraženih županija, što je znatno više nego nađena preva­lencija (14,9%) u Njemačkoj (Schielke i sur., 2009.). U Brodsko-posavskoj županiji utvrđena je virološka preva­lencija u 31,3%, u Sisačko-moslavačkoj u 30,5 i u Virovitičko-podravskoj u 28,6% pretraženih svinja. Najviše je pozitivnih rezultata u sve tri županije nađeno u svinja do jedne godine sta­rosti (66,6%), neovisno o spolu, što odgovara dinamici infekcije opisanoj u domaćih svinja (De Deus i sur., 2008.).
U pretraženih divljih svinja s područja Osječko-baranjske, Koprivničko-križevačke, Krapinsko-zagorske i Zagrebačke županije nije utvrđena RNK virusa hepatitisa E.
U domaćih i divljih svinja, utvrđena je infekcija HEV u Brodsko-posavskoj, Sisačko-moslavačkoj i Virovitičko-pod­ravskoj županiji. Premda je u farme B iz Osječko-baranjske županije utvrđen virus, istodobno u divljih svinja nije. To upućuje na zaključak da dobre biosigurnosne mjere mogu u cijelosti spriječiti kontakt između domaćih i divljih svinja, što je osnovni uvjet za širenje infekcije. Iz Virovitičko-podravske županije, zaprimljeni su uzorci od sedam divljih svinja, od kojih su dva dala pozitivan rezultat na RNK HEV. Jedan od pozitivnih uzoraka je uzet od mužjaka divlje svinje starije od dviju godina, što s obzirom na kretanja mužjaka u dijametru od i do 50 kilome­tara ne mora sa sigurnošću ukazivati na postojanu infekciju divljih svinja s HEV u toj županiji. Na žalost, drugi nađeni pozitivan uzorak je nepoznatog podri­jetla. U Krapinsko-zagorskoj županiji virus hepatitisa E nije utvrđen ni u domaćih ni u divljih svinja.
Za razliku od pozitivnih nalaza u domaćih i divljih svinja, u uzoraka srna i jelena dostavljenih na pretraživanje nije nađena RNK virusa HEV. Za si­gurnu procjenu prevalencije u jelenske divljači u Hrvatskoj, valjalo bi provesti uzorkovanje s većeg područja i pored dokazivanja virusne RNK obaviti i serološko ispitivanje.
S obzirom da je HEV moguće preni­jeti s inficiranih životinja na čovjeka putem unosa termički nedovoljno obrađenih prehrambenih proizvoda životinjskog podrijetla (Takahashi i sur., 2002.), ali i putem izravnog kontakta (Meng i sur., 2002.), postoji opasnost od infekcije onih ljudi koji su u stalnom dodiru s potencijal­nim rezervoarima virusa. Istraživanje serološke prevalencije HEV u veterinara i uzgajivača svinja u odnosu na prevalenciju u ljudi ostalih struka po­kazala je da su veterinari i uzgajivači svinja u većem riziku od potencijalne infekcije HEV od ostalih. Prema Bayesian analizi, dobiveni rezultati ukazuju da je u veterinara koji su u izravnom kontaktu sa svinjama sero­prevalencija iznosila 11%, veterinara koji nisu u iz­ravnom kontaktu sa svinjama 6%, a u ostale ispitivane populacije svega 2% (Bouwknegt i sur., 2008.). Dokazano je i da je seroprevalencija u ljudi koji čiste nastambe za svinje ili pomažu pri pra­senju 2,46 puta veća nego u kontrolne skupine (Drobeniuc i sur., 2001.). U Re­publici Hrvatskoj do danas nisu prove­dena slična ispitivanja te je stvarna slika proširenosti infekcije u ljudi nedovoljno poznata. S obzirom na preliminarne rezultate našeg istraživanja, trebalo bi nastaviti s epidemiološkom studijom i uključiti rezultate istraživanja javnog zdravstva zbog usporedbe nalaza i dobivanja uvida u mogući prijenos vi­rusa sa životinja na ljude. Takvi bi re­zultati bili od posebne važnosti za one ljude koji svakodnevno dolaze u doticaj s domaćim i divljim svinjama, poput veterinara, uzgajivača svinja na farma­ ma ili u dvorištima te lovaca.

Zaključci

---

1. HEV je dokazan u uzorcima podrije­tlom od domaćih i divljih svinja s područja Republike Hrvatske. U našem istraživanju HEV do danas nije dokazan u srna i jelena.
2. Zbog značenja HEV infekcije u ljudi, treba nastaviti istraživanje proširenosti virusa HEV u drugih vrsta domaćih i divljih životinja i naći poveznice, ako postoje, s infek­cijom u ljudi.
3. Kako je virus dokazan u domaće i divlje svinje, treba pri radu s njima osigurati sve biosigurnosne mjere kako bi se smanjila opasnost od širenja virusa.
4. Potrebno je proširiti istraživanje na ostale potencijalne izvore infekcije, ponajprije namirnice životinjskog podrijetla, kako bi se utvrdio rizik od pojave infekcije u ljudi.

Sažetak

---

Hepatitis E je danas jedan od najčešćih uzroka akutnih upala jetara u ljudi. Premda se bolest ponajprije ja­vlja u zemljama u razvoju kada popri­ma epidemijske razmjere, opisane su i sporadične infekcije, većinom nepoznatog izvora diljem svijeta.
Uzročnik hepatitisa E je RNK virus, koji pripada rodu Hepevirus, porodici Hepeviridae. Genom HEV (HEV) ob­likuje jednolančana RNK molekula pozitivnog naboja, a veličine oko 7,2 kb. Na njenom se 3’ i 5’ kraju nalaze ne-prepisujuće regije (engl. Non-Coding Region ili NCR), između kojih su smještena tri otvorena okvira čitanja (engl. Open Reading Frame – ORF). Poznata su do da­nas četiri genotipa virusa hepatitisa E.
Genotipovi 1 i 2 su izdvojeni isključivo iz ljudi i najčešći su uzročnici endem­skog hepatitisa E koji pokazuje ten­denciju širenja u epidemijske razmjere i to najčešće u zemljama u razvoju.
Genotipovi 3 i 4 su izdvojeni iz ljudi i različitih vrsti sisavaca, a odgo­vorni su i za sporadične pojave hepatitisa E u zemalja u razvoju, ali i u razvijenih zemalja. Nukleotidni odsječci ptičjeg HEV su podudarni svega u 50% s os­talim poznatim genotipovima HEV te on najvjerojatnije predstavlja novi rod unutar porodice Hepeviridae. Bez obzi­ra na opsežne varijacije nukleotidnih odsječaka različitih genotipova HEV-a, do danas je utvrđen samo jedan serotip (Meng, 2006.). Hepatitis E je značajan javno-zdravstveni problem čija se poja­va ponekad može povezati i s izravnim i učestalim doticajem ljudi s rezervoar­ima virusa tj. inficiranim životinjama. Stoga veterinari, kao i uzgajivači životinja, a naročito svinja, mogu pri­padati rizičnim skupinama za infekciju s HEV (Meng i sur., 2002.). U ovom smo radu prikazali preliminarne rezultate našeg istraživanja prevalencije virusa hepatitisa E na području Republike Hrvatske u domaćih i divljih svinja te srna i jelena. Ujedno smo željeli ukazati na značenje životinja kao potencijalnih izvora infekcije hepatitisom E u ljudi.

Literatura [… prikaži]

Hepatitis E – are we threatened?

---

Lorena JEMERŠIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Besi ROIĆ, DVM, PhD, Senior Scientific Associate, Jelena BALATINEC, MSc, Biolog, Tomislav KEROS, DVM, PhD, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

---

Hepatitis E is one of the most com­mon causes of acute hepatitis in hu­mans. Though the disease is endemic in developing countries, sporadic cases of hepatitis E have also been reported in industrialized countries worldwide.
The source of infection in these cases often remains unknown. The causative agent of hepatitis E is an RNA virus (HEV) belonging to the genus Hep­evirus, family Hepeviridae. Its genome consists of a single stranded positive RNA molecule of 7.2 kb. Non-coding regions are located at the 3’ and 5’ ends of the molecule, with three open read­ing frames in between. Four HEV genotypes have been recognized to date.
Genotypes 1 and 2 are human specific and mostly isolated in areas where HEV is endemic with a tendency of epidemic expansions, mostly in devel­oping countries. Genotypes 3 and 4 are isolated from humans and other mam­mals. They can cause sporadic cases of hepatitis E in humans in both develop­ing and industrialized countries. HEV isolates found in poultry account for approximately 50% of the sequence identity of known isolates, and thus may constitute a separate new genus within the Hepeviridae family. In spite of the nucleotide diversity among HEV isolates, only one serotype has been
recognised (Meng, 2006). Hepatitis E is an important public health concern due to the possibility of zoonotic trans­mission through contact with infected animals. Therefore, veterinary professionals and animal breeders, especially pig breeders, may be at a higher risk of developing the disease. This study is a report of our preliminary results of HEV findings in known animal res­ervoirs, domestic pigs and wild boars, and in roe and red deer. We have also aimed to stress the importance of ani­mals as possible sources of hepatitis E infection.