Indukcija estrusa u kuja (*)

Darko Gereš¹, Silvio Vince¹, Koraljka Crnković¹, Branimira Špoljarić^1
1 Klinika za porodništvo i reprodukciju, Veterinarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu
² Udruga “Silver”

SAŽETAK

---

Istraživana je učinkovitost kombinirane primjene eCG (PMSG; seruma ždrebnih kobila; konjskog korionskog gonadotropina) i hCG (korionskog gonadotropina žena) u indukciji fertilnog estrusa u zdravih kuja. Sedamnaest kuja u kasnom anestrusu podijeljeno je u dvije skupine. Kujama iz skupine A(n=11) kroz pet dana, jedanput dnevno apliciran je eCG, 20IU/kg, a šestog dana hCG, 1500 IU. Kujama iz kontrolne (B) skupine aplicirano je 1ml fiziološke otopine tijekom šest dana. Kujama iz obje skupine uzorkovani su brisevi sluznice vagine počev od prvog dana (1. dan pokusa pa nadalje 4., 6., 12., 18., 24., 28. i 32. dana) kako bi se konstatirao anestrus, potom detektirao početak estrusa te odredilo vrijeme za pripust ili umjetno osjemenjavanje, kao i početak diestrusa. Uzorci krvi za određivanje razine progesterona P4 uzeti su venepunkcijom 1. dana pokusa i 4. dana kujama iz skupine A, kako bi se konstatirao anestrus, a eventualna elevacija bila najava estrusa. Kujama iz skupine B anestrus je utvrđen anamnestički iz podataka o prethodnom estrusu te potvrđen citološki. Devet od jedanaest (9/11; 81,81%) kuja iz skupine A imale su izražen estrus, a svega jedna iz skupine B (1/6; 16,66%) (P<0.01). Interval od aplikacije do početka estrusa u 3 kuje iz skupine A bio je 6 dana (postotak zrelih, kornificiranih stanica (80-90%), u tri kuje 12 dana (80-90%), jedne 18 (90%), jedne 24 (80%) i jedne 28 (80%). Prosječno median vrijeme od aplikacije do početka estrusa u kuja skupine A iznosilo je 12,0±7,3 dana.

Prosječna koncentracija serumskog progesterona P4 u skupini A prije tretmana bila je 0,68±0,54 ng/ml, a poslije 5,04±0,54 ng/ml. Prosječni interval od početka tretmana do prvog dana diestrusa u skupini A bio je 19,4 dana. Od ukupno 9 kuja iz skupine A koje su se parile (n=4) ili su UO (n=5), u 55,56% (5/9) je dijagnosticirana skotnost i sve su oštenile. Od 5 umjetno osjemenjenih kuja 3 su se oštenile (3/5, 60%), a od 4 prirodno pripuštene, dvije su se oštenile (2/4; 50%). Cilj istraživanja bio je dokazati učinkovitost kombiniranog protokola (5 dana eCG i šesti dan hCG) u indukciji fertilnog estrusa.

Istraživanjem je dokazana učinkovitost indukcijskog protokola kombiniranog tretmana eCG, 20IU/kg, tijekom 5 dana i šestog dana hCG (1500 IU) u zdravih kuja u kasnom anestrusu.
Ključne riječi: indukcija, estrus, kuja, hCG/eCG

Uvod

Indikacije za indukciju estrusa u kuja su brojne, od mogućih poremećaja u rasplođivanju, izostanku koncepcije i prvenstveno liječenje primarnih i sekundarnih anestrija, poboljšanje plodnosti, odnosno češće polučivanje većih legala i konačno sinkronizacija ovulacije u postupku embriotransfera. Kuje su životinje sa dominantno sezonski monoestričnim ciklusom (VERSTEGEN et al., 1999a). Ciklus se javlja najčešće jedanput, ali moguće dvaput čak triput godišnje, a kuje spontano ovuliraju jedanput ili dvaput u bilo koje doba godine. Točnije je reći kako se ciklus u kuja javlja tijekom cijele godine, iako je vrhunac sezone kasno zimi i u rano proljeće. Postoje i iznimke, poput pasa pasmine Tibetski mastif i Basenji, koji imaju jednu sezonu, poput mačaka (FULLER, 1956; JOHANNES, 2003).

Trajanje ciklusa dulje je nego u većine domaćih životinja, a posebnost je što poslije lutealne faze, koja traje prosječno 65 dana, slijedi 5-6 mjeseci dugo razdoblje anestrije.

U prosjeku, proestrus nastupa otprilike svakih sedam mjeseci, budući interestrus obično traje 5-11 mjeseci. Može biti kraći od 3,5 mjeseca, ali i dulji od 13 mjeseci, premda su intervali kraći od 4 mjeseca i dulji od 12 mjeseci u pravilu posljedica smanjene plodnosti ili neplodnosti (VERSTEGEN i sur., 1999a; FELDMAN i NELSON, 2004; ROMAGNOLI 2008; ENGLAND i RUSSO, 2009; CONCANNON, 2011).

Interestrus je vrijeme od početka proestrusa do sljedećeg početka estrusa i uključuje proestrus, estrus, diestrus i obligatni anestrus. U nekih je kuja estrus slabije izražen zbog produljenog interestrusa (persistentnog anestrusa). Interestrus prosječno traje 31 tjedan (16 do 56 tjedana) (ROWLANDS, 1950; CHRISTIE i BELL, 1971), a u kuja sa duljim interestrusom smanjena je fertilnost (CHAKRABORTY i sur., 1982).

Čimbenici koji prekidaju anestrus i potiču estrus nisu sasvim razjašnjeni, ali u kuja na prijelazu iz ranog u kasni anestrus povišena je amplituda i frekvencija pulzacije hipotalamičkog gonadotropnog rilizing hormona (GnRH), kao i senzibilnost hipofize prema GnRH, prema tome i jajnički odgovor u vidu otpuštanja luteinizirajućeg (LH) i folikulo-stimulirajućeg (FSH) hormona (JEFFCOATE,1993; Van HAAFTEN i sur., 1994; TANI i sur., 1996). Koncentracija serumskog FSH povišena je kroz najveći dio anestrusa dok je razina LH niska sve do kraja anestrusa. Taj porast bazalne koncentraccijae FSH odlučujući je za početak folikulogeneze, pri čemu FSH potiče ekspresiju LH receptora u granuloza stanicama jajnika. Nakon inicijalne folikulogeneze, LH progresivno nastoji zamijeniti FSH u procesu maturacije folikula (CONCANNON, 1993; MONNIAUX i sur., 1997; KOOISTRA i sur., 1999; ONCLIN i sur., 2001).

Anestrija može biti primarna (u kuja koje nikada nisu imale ciklus) i sekundarna (kuje koje su u prošlosti imale ciklus ili više njih ali su naknadno postale anestrične).
Često, zbog dugog trajanja interestrusa, vlasnici žele indukciju estrusa, međutim ona se prakticira samo u slučaju fiziološkog ciklusa bez funkcionalnih poremećaja, bez razvojnih ili stečenih abnormalnosti. Upravo zbog dugog perioda anestrije, koji uvijek slijedi lutealnu fazu, za razliku od drugih domaćih životinja, estrus u kuja nije moguće inducirati skraćenjem lutealne faze prostaglandinom (FELDMAN i NELSON, 2004b; EILTS, 2010). Brojne su metode indukcije uporabom različitih egzogenih hormona, ali i njihove kombinacije sa drugim supstancama. Vjerojatno najučinkovitija metoda je indukcija dopaminskim agonistima. U kuja je prolaktin važan u interestrusu, jer vjerojatno uzrokuje sekreciju GnRH, ili jajnički odgovor na gonadotropni podražaj.

Inhibicijom prolaktina pomoću agonista, skraćuje se trajanje anestrije, odnosno inducira estrus (JOCHLE i sur., 1987; ARBEITER i sur., 1988; Van HAAFTEN i sur., 1994; HARVEY i sur., 1999; PHILLIPS i sur., 2003; KUTZLER, 2005), uz visoku stopu koncepcije, kao kod spontanog ciklusa (ENGLAND, 2010). Kombinacija seruma ždrebnih kobila, produkta vrčastih stanica endometrija ždrebnih kobila eCG (PMSG), dominantno FSH učinka, u kombinaciji sa korionskim gonadotropinom iz urina gravidnih žena (hCG), sa dominantnim LH učinkom, danas se rutinski primjenjuje (ENGLAND, 1998). Ova kombinacija pripravaka koji se koriste u različitim dozama, ritmu i trajanju aplikacije polučuje varijabilne rezultate u indukciji i koncepciji (SHILLE, 1984; VANDERLIP i sur., 1987; CONCANNON, 1992; BOUCHARD i sur., 1993). Cilj istraživanja bio je dokazati učinkovitost kombinirane primjene eCG/hCG u indukciji fertilnog estrusa.

Naravno da je indukcija najuspješnija u kuja sa fiziološkim, zdravim ciklusom, dok je učinkovitost u kuja s reprodukcijskim poremećajima diskutabilna. Važno je voditi računa da se histološke promjene, slične involuciji, odvijaju i u negravidnom ciklusu.
Dakle, i u negravidnih kuja reparacija endometrija je inkompletna unutar 135 dana nakon estrusa, (ANDERSON i SIMPSON, 1973). CHAKRABORTY i sur. (1982) su dokazali da je indukcija fertilnog estrusa ugrožena kada započne prije 4. mjeseca od početka zadnjeg proestrusa (ANDERSON i SIMPSON, 1973).
Egzogeni LH i FSH u farmakološkim dozama (svaki zasebno ili zajedno) induciraju estrus. Ipak, nisu bili učinkoviti (CONCANNON, 1993; SHILLE i sur., 1984).
Kombinirana primjena PMSG i hCG apliciranih svaki zasebno, rezultirala je stopom štenjenja od 50-84% (SCROGIE, 1939; BARDENS, 1971; TAKEISHI i sur., 1976; NICKSON i sur., 1992).

MATERIJAL I METODE

Istraživanje je provedeno na 17 zdravih kuja u kasnom anestrusu. Kuje su bile različitih, pasmina: 8 labradora, 4 retrivera, 2 staford terijera te po jedna pasmine bokser, njemački ovčar i buldog. Kuje su bile u dobi od 3 do 6 godina.
Kuje korištene u pokusu bile su pacijenti Klinike (9) te iz privatne prakse (8).
Kuje su podijeljene u dvije skupine. Kuje iz pokusne skupine (skupina A, n=11) tretirane su tijekom 5 dana sa eCG (20 IU/kg, im; Folligon®, Intervet) i 6. dana jedokratnom dozom hCG (1500 IU, im; Choluron®, Intervet). Kuje iz kontrolne skupine (skupina B, n=6) tretirane su fiziološkom otopinom kroz 6 dana, 1 mL, im).
Uzorci krvi za određivanje koncentracije serumskog progesterona (P4) uzeti su vakutainerom iz vene cefalike samo u kuja iz skupine A. Prva venepunkcija načinjena je prvi puta prije početka indukcijskog protokola, kako bi se potvrdio anestrični status, a drugi puta nakon ginekološki i citološki potvrđenog estrusa.
Svi uzorci krvi su centrifugirani i pohranjeni duboko smrznuti (-20 °C) do analize metodom RIA.
U kuja iz skupine B registrirani su datumi prethodnog estrusa.
U svih kuja načinjena je vaginalna citologija 1. dana pokusa (istovremeno sa uzorkovanjem krvi za P4), a potom sve dok nije temeljem opažanja estrusnog ponašanja i vaginalne citologije ustanovljen estrus, unutar 4., 8., 12., 18., 24., 28. i 32. dana. Citološka pretraga činjena je uzimanjem obriska vatenim štapićem sa eksternalnog cervikalnog porcija. Na predmetnici je načinjen bris koji je fiksiran metanolom 99%. Nakon 2 minute predmetnica je isprana destiliranom vodom i potom prelivena 5% otopinom Giemse. Nakon 10 minuta predmetnica je isprana destiliranom vodom i osušena na zraku. Obojeni obrisci pregledavani su pod malim povećanjem (10-40x).
Kuje koje nisu prirodno parene, umjetno su osjemenjene nativnim sjemenom.
Parenje je trajalo sve dok su kuje ginekološki i citološki bile u požudi i pokazivale interes za mužjaka. Umjetno osjemenjavanje provodilo se polučivanjem sjemena mužjaka manualnom fiksacijom, uz prisustvo ženke sve do završetka estrusa, ustanovljeno ginekološki i eksfolijativnom vaginalnom citologijom te temeljem dana posljednjeg pripusta/osjemenjavanja, odnosno danom kada kuje više nisu bile u požudi.
Podaci su statistički analizirani programskim paketom SAS (SAS 9.2), procedurom MEANS i FREQ za deskriptivnu statistiku te procedurom GLM za analizu P4 prije početka i tijekom tretmana.

REZULTATI

Koncentracija serumskog progesterona P4 u skupini A prije tretmana bila je 0,68±0,54 ng/ml, a poslije tretmana 5,04±0,54 ng/ml (p<0,001). Nakon aplikacije eCG/hCG, u devet kuja su se javili izraženi znakovi estrusnog ponašanja (9/11; 81,81%). Prosječno median vrijeme od početka tretmana do početka estrusa bilo je 12,0±7,3 dana.
Citološki nalaz bio je na početku aplikacija identičan u svih kuja iz obje skupine. Nakon aplikacija, devet od jedanaest (9/11; 81,81%) kuja i z skupine A imale su izražen estrus, a svega jedna iz skupine B (1/6; 16,66%) što je iznosilo p<0,01.

DISKUSIJA

Serum ždrebnih kobila (PMSG ili točnije eCG) u kombinaciji sa korionskim gonadotropinom gravidnih žena (hCG) u gotovom industrijskom pripravku nije pogodan za kuje jer podrazumijeva istovremenu primjenu oba hormona (PG600R, Intervet). Odvojena egzogena primjena istih bioloških pripravaka bila je učinkovita uz stopu koncepcije 50-84%. U pokusu od devet kuja koje su parene ili umjetno osjemenjene, 55,56% (5/9) se oštenilo.
PMSG je najčešće korišten gonadotropin za indukciju estrusa jer se pokazao učinkovitiji nego FSH. Gotovi industrijski pripravak PG600® u mililitru sadržava 80 IU PMSG 40 IU hCG pokazao se učinkovit u indukciji proestrusa, međutim bio je slabog učinka u indukciji ovulacije, a nije rezultirao koncepcijom. Još je jedan problem nazočan, a to je nepredvidivost reakcije kuje. Naime, moguće je da će se razviti pretjeran broj folikula, što u kuja može izazvati alergiju i može izazvati preuranjenu luteolizu (BARTA i sur.,1982; CARTER, 1980; GREENBLATT i PUND, 1941). Za razliku od tog pripravka, kombinacija PMSG i hCG rezultirala je visokom koncepcijom i stopom štenjenja od od 50–84% (NICKSON i sur.,1992; TAKEISHI i sur., 1976). To potvrđuju i rezultati istraživanja prema kojem je 55,56% kuja koncipiralo i oštenilo se. Problem što PMSG nekontrolirano uzrokuje razvoj velikog broja folikula (superovulaciju) i kako se radi o biološkim pripravcima, moguću alergijsku reakciju te prematurni lutealni defekt. Tako je zabilježen i slučaj bokserice sa jakom alergijskom reakcijom nakon druge injekcije PG600, čak i slučaj kuje koja je neočekivano uginula nakon tretmana (GREENBLATT i PUND, 1941; CARTER, 1980).

U pokusu je anamnestički, citološki i mjerenjem razine P4 utvrđen kasni anestrus i to je bilo polazište, jer je postupak indiciran samo u kuja sa trajanjem anestrusa duljim od 31-nog tjedna (OKKENS i KOOISTRA, 2006; ANDERSON i SIMPSON, 1973).

Učinak postupka u kojem se 5 od 9 tretiranih kuja (55,56%) oštenilo na donjoj je granici u usporedbi sa najboljim rezultatima autora koji su primijenili identične pripravke, ali u drugačijim modalitetima i čiji su se rezultati kretali od 50-84% (BARDENS, 1971; TAKEISHI i sur., 1976; NICKSON i sur., 1992). STORNELLI i sur. (2009) dvadeset anestričnih kuja tretirali su jednokratno sa 50IU eCG, a sedam dana kasnije sa 500IU hCG uz prosječni nastup estrusa za 4,5 dana, prosječno vrijeme do nastupa diestrusa 16,64 dana i postotak koncepcije 93%. STORNELLI i sur. (2012) su 25 anestričnih tretirali jednokratno različitim dozama eCG (5, 10, 15, 20, 44, ili 50 IU/kg im).

Najbolje su reagirale kuje tretirane najvišm dozom (50 IU) i u njih je prosječno vrijeme do nastupa estrusa bilo 4.0 ± 0.4 dana, a 7. dana im je apliciran hCG uz stopu skotnosti od 80% i skraćenje interestrusa za 48 dana. Učinkovitost eCG-a viša je u dozi od 50IU (u usporedbi sa opserviranim pokusom gdje je doza iznosila 20IU). Također se može zaključiti da je jednokratna aplikacija više doze učinkovita i da nema potrebe opetovati aplikacije, jer PMSG i jedokratno potiče folikulogenezu. Tome u prilog govori i raniji nastup estrusa i diestrusa u istraživanju citiranih autora u odnosu na naš pokus.

ZAKLJUČAK

Brojni su protokoli za indukciju estrusa u kuja, međutim rezultat i uspjeh indukcije, ovulacije i konačnog rezultata, štenjenja, signifikantno variraju ne samo kod različitih protokola već i unutar jednakih protokola. U našem istraživanju učinak je u odnosu na ukupnu učinkovitost indukcijskih protokola zadovoljavajući, ali zahtijeva izmjene u načinu i doziranju eCG.

Literatura [… prikaži]