Jelka Pleadin ¹, Ana Vulić ¹, Nina Perši ¹, Mario Škrivanko ², Mario Mitak ¹, Brankica Capek ³, Željko Cvetnić ¹

¹ Hrvatski veterinarski institut Zagreb, Savska cesta 143, 10000 Zagreb
² Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Vinkovci, Josipa Kozarca 24, 32100 Vinkovci
³ Ministarstvo poljoprivrede Republike Hrvatske, Planinska ulica 2a, 10000 Zagreb

Sažetak

---

Rad prikazuje rezultate određivanja razina aflatoksina B₁ (AFB₁) u krmivima i krmnim smjesama sa farmi mliječnih goveda iz istočnog dijela Hrvatske, uzorkovanih u prvoj polovini 2013. godine nakon utvrđene kontaminacije mlijeka. Rezultati istraživanja ukazali su na vrlo velike količine AFB₁ u kukuruzu, značajno veće u odnosu na dopuštenu vrijednost propisanu zakonodavstvom, te posljedičnu kontaminaciju krmnih smjesa za mliječna goveda u čijoj se proizvodnji kukuruz koristi u značajnom udjelu.

Kontaminacija sa AFB₁ može se povezati s vremenskim uvjetima tijekom uzgoja i žetve kukuruza u 2012. godini, a koji su visokim temperaturama i niskom količinom oborina pogodovali produkciji AFB₁.

Nedovoljna dosušenost i neki drugi čimbenici također su mogli pospješiti tvorbu ovog toksina tijekom skladištenja. Kako bi se prevenirao štetan utjecaj AFB₁ za zdravlje životinja i ljudi, ali i umanjili gubitci u poljoprivrednoj proizvodnji, važan je sustavan nadzor te provedba daljnjih istraživanja kontaminacije krmiva i krmnih smjesa ovim mikotoksinom.

---

Ključne riječi: aflatoksin B₁, krmiva, krmne smjese, kontaminacija, Istočna Hrvatska

Uvod

Krmiva i krmne smjese čest su izvor kontaminacije mikotoksinima kao toksičnim kemijskim spojevima koji predstavljaju značajan problem za sigurnost hrane te zdravlje ljudi i životinja. Aflatoksine proizvode plijesni iz roda Aspergillus, posebno Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus, a najznačajniji predstavnik ove skupine je aflatoksin B₁ (AFB₁). AFB₁ nastaje pod određenim uvjetima temperature, aktiviteta vode, prisutnosti insekata i dostupnosti hranjivih tvari te je čest kontaminant usjeva, naročito u tropskim i suptropskim područjima gdje vremenske prilike pružaju optimalne uvjete za rast ovih plijesni i produkciju ovog toksina (Rustom, 1997).

AFB₁ uzrokuje bolesti, tzv. aflatoksikoze, te predstavlja snažan mutagen, teratogen i najpotentniji hepatocarcinogen poznat u sisavaca (Eaton i Gallagher, 1994). Toksičnost za ljude i životinje ovisna je o brojnim čimbenicima, kao što su trajanje, doza i način izloženosti, dob, zdravstveno stanje te stupanj uhranjenosti (FAO, 2004). Klasificiran je od strane Međunarodne agencije za istraživanje raka kao karcinogen skupine 1 (IARC, 1993). Kronično izlaganje životinja AFB₁ uzrokuje razne štetne učinke kao što su povećana osjetljivost na bolesti, odbijanje hrane, gubitak reproduktivne sposobnosti i težine te smanjenje stope rasta. Aflatoksin M1 (AFM1) se izlučuje u mlijeko preko mliječnih žlijezda goveda koja su jela hranu kontaminiranu sa AFB₁. AFM1 je stabilan spoj koji se ne reducira primjenom različitih postupaka prerade hrane, pa tako ni pasterizacijom i sterilizacijom mlijeka i mliječnih proizvoda (Prandini i sur., 2009), a izloženost već i malim količinama može značajno narušiti ljudsko zdravlje, osobito djece koja su glavni konzumenti ovih proizvoda.

U prvoj polovici 2013. godine u kravljem mlijeku u Hrvatskoj utvrđene su količine AFM1 iznad najveće dopuštene količine propisane zakonodavstvom. S obzirom na spoznaju da AFM1 nastaje isključivo metabolizmom AFB₁, ispitivana je kontaminacija krmiva i krmnih smjesa korištenih u ishrani mliječnih krava sa AFB₁. U ovom radu dan je pregled utvrđenih količina AFB₁ u promatranom razdoblju u uzorcima sa farmi istočnog dijela Hrvatske.

Materijal i metode

Uzorkovanje
U razdoblju od veljače do travnja 2013. godine Veterinarska inspekcija Ministarstva poljoprivrede uzorkovala je 856 uzoraka krmiva i krmnih smjesa sa farmi mliječnih goveda u istočnom dijelu Hrvatske (6 županija). Uzorci su dostavljeni u Hrvatski veterinarski institut Zagreb na analizu AFB₁. Od navedenog broja, 711 uzoraka činile su različite vrste krmiva korištenih u proizvodnji krmnih smjesa, a 145 uzoraka bile su smjese korištene na farmama u ishrani mliječnih krava.

Priprema uzoraka
Uzorci su usitnjeni u fini prah na analitičkom mlinu (Cylotec 1093, Tecator) uz prethodno određivanje udjela vlage (w/w, %). 5 g uzorka homogenizirano je sa 25 mL 70% metanola i ostavljeno na tresilici tijekom 3 min pri brzini od 300 o/min (HS 260 Control, Ika). Ekstrakt je filtriran (Whatman, crna vrpca) te je 1 mL dobivenog filtrata razrijeđeno s odgovarajućim volumenom redestilirane vode. Kemikalije korištene u pripremi uzoraka bile su analitičke čistoće.

Određivanje količine AFB₁
U određivanju AFB₁ korištena je validirana screening imunoenzimska ELISA metoda.
ELISA kit (R-Biopharm, Darmstadt, Njemačka) sadrži mikrotitracijsku ploču s 96 jažica, otopine AFB₁ standarda (0, 1, 5, 10, 20, i 50 g/L), peroksidaza-konjugat AFB₁, supstrat/kromogen (urea peroksid), stop otopinu (1 N sumporna kiselina) i pufer za ispiranje (10 mM fosfatni pufer, pH=7.4). Analize su provedene u potpunosti u skladu s uputama proizvođača kita uz uporabu automatiziranog analizatora ChemWell 2910 (Awareness Technology, USA). Standard AFB₁ za provjeru iskorištenja analitičkog postupka nabavljen je od Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Njemačka). Nakon konstruiranja baždarne krivulje, uzimajući u obzir faktor razrjeđenja, u uzorcima je određena količina AFB₁ (mg/kg). Statistička analiza provedena je korištenjem programa Statistica Ver. 10 (StatSoft Inc. 2011, USA), a p vrijednosti manje od 0,05 smatrane su značajnim.

Rezultati i rasprava

U većem broju uzoraka mlijeka sa farmi mliječnih krava iz istočnog dijela Hrvatske, u prvom dijelu 2013. godine, utvrđene su količine AFM1 veće od dopuštenih zakonodavstvom (Uredba Komisije 1881/2006). Literaturni podaci pokazuju da je prisutnost AFM1 u mlijeku isključivo posljedica ishrane farmskih životinja krmnim smjesama kontaminiranim sa AFB₁ (Prandini i sur., 2009). S ciljem utvrđivanja potencijalnih izvora kontaminacije mlijeka, provedeno je opsežno uzorkovanje krmiva i krmnih smjesa sa ovog područja u kojima je analizirana količina AFB₁. Određene prosječne količine AFB₁, pojedinačno po vrsti krmiva i u gotovim krmnim smjesama te njihova usporedba sa najvećim dopuštenim količinama (NDK), propisanim Direktivom 2002/32/EZ, prikazane su u tablici 1. Srednje vrijednosti AFB₁ po županijama, u kukuruzu i krmnim smjesama u kojima je AFB₁ detektiran, prikazane su na slici 1.

Rezultati istraživanja pokazuju da je AFB₁ detektiran u 60,6% uzoraka kukuruza, a u 37,4% uzoraka određena je količina ovog toksina veća od NDK propisane Direktivom.

Najveća određena količina od 2,070 mg/kg je oko 100 puta veća od NDK. U ostalim vrstama krmiva (pšenica, ječam, zob, soja, suncokret, silaža i krmno brašno) AFB₁ uglavnom nije detektiran ili su određene statistički značajno manje količine koje su u skladu s propisanim. S obzirom na vrlo visoku razinu kontaminacije kukuruza, povećane razine AFB₁ u mješavinama krmiva (24,8%) te krmnim smjesama (33,8%) su očekivane.

Utjecaj vremenskih uvjeta na nastanak AFB₁ opisan je u ranijim istraživanjima (Bryden, 2012), a poznato je da rastu plijesni iz roda Aspergillus pogoduju vrući i suhi vremenski uvjeti, uz optimalnu temperaturu rasta 25 – 42 oC (Santin, 2005). Također, podloge bogate ugljikom povoljne su za rast Aspergillus vrsta te se obično pronalaze kao kontaminanti namirnica bogatih škrobom. Udio škroba u zrnu kukuruza je vrlo visok (73%) te svojim sastavom predstavlja izuzetno pogodan medij za njihov rast i daljnju tvorbu AFB₁ (EFSA, 2004). U nedugo provedenim istraživanjima (Karami-Osboo i sur., 2012; Kos i sur., 2013) nedostatak oborina i velika suša određeni su kao glavni čimbenici koji su utjecali na proizvodnju AFB₁ u kukuruzu. Nadalje, pojedini agronomski faktori (tip hibrida, vrsta i obrada tla) te uvjeti rukovanja i skladištenja (oštećenje zrna, različiti insekti, nedosušenost zrna) također značajno utječu na njegovu produkciju (Garrido i sur., 2012).

Visoka razina kontaminacije kukuruza sa AFB₁ u Hrvatskoj može se isto tako objasniti vremenskim uvjetima u 2012. godini, s obzirom da su prema podacima Državnog hidrometeorološkog zavoda Hrvatske zabilježena izuzetno vruća i sušna razdoblja, definirana kao ekstremno topla, te s vrlo niskom prosječnom količinom oborina.
Takvi uvjeti bili su izuzetno povoljni za nastanak plijesni, a tvorbi AFB₁ su zasigurno pridonijeli i neprikladni uvjeti pohrane kukuruza. S obzirom na razinu kontaminacije kukuruza, te posljedično i krmnih smjesa, razumljivo je da je ishrana goveda takvom hranom rezultirala povećanom količinom AFM1 u mlijeku.
U cilju buduće prevencije ovih slučajeva nužna je implementacija HACCP (Hazard Analysis Critical Control Points) programa, uz analizu unaprijeđenja poljoprivredne prakse odnosno uvjeta proizvodnih procesa i skladištenja usjeva te primjena screening i potvrdnih analitičkih metoda koje omogućuju nedvojbenu detekciju ovih spojeva.
Potrebna je kontinuirana realizacija godišnjih programa monitoringa hrane za životinje uz analizu ciljanog broja reprezentativnih uzoraka na različite mikotoksine te praćenje faktora rizika kao što su vremenski uvjeti te ostali prepoznati kao značajni za tvorbu mikotoksina. Pravilno skladištenje, suzbijanje rasta plijesni, ali i dekontaminacija krmiva različitim postupcima, sprječavaju produkciju AFB₁ te njegovo toksično djelovanje na zdravlje ljudi i životinja.

Bryden, W.L. (2012) Mycotoxin contamination of the feed supply chain: Implications for animal productivity and feed security. Anim Feed Sci Tech. 173, 134-158.
Direktiva 2002/32/EZ Europskog parlamenta i Vijeća od 7. svibnja 2002. o nepoželjnim tvarima u hrani za životinje.
Eaton, D.L., Gallagher, E.P. (1994) Mechanisms of aflatoxin carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 135-172.
European Food Safety Authority (2004) Request No EFSA-Q-2003-035. The EFSA Journal 39, 1-27.
FAO (2004) Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. FAO Food Nutr. Pap., 1.
Garrido, C.E., Hernández Pezzani, C., Pacin, A. (2012) Mycotoxins occurrence in Argentina’s maize (Zea mays L.), from 1999 to 2010. Food Cont. 25, 650-665.
International Agency for Research on Cancer (1993) IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, Lyon, 599 pp.
Karami-Osboo, R., Mirabolfathy, M., Kamran, R., Shetab-Boushehri, M. (2012) Food Cont. 23, 271-274.
Kos, J., Mastilović, J., Janić Hajnal, E., Šarić, B. (2013) Natural occurrence of aflatoxins in maize harvested in Serbia during 2009–2012. Food Cont. 34, 31-34.
Prandini, A., Tansini, G., Sigolo, S., Filippi, L., Laporta, M., Piva, G. (2009) On the occurrence of aflatoxin M1 in milk and dairy products. Food Chem. Toxicol. 47, 984-991.
Rustom, I.Y.S. (1997) Aflatoxin in food and feed: occurrence, legislation and inactivation by physical methods. Food Chem. 59, 57-67.
Santin, E. (2005) Mould growth and mycotoxin production. In Mycotoxin blue book (pp. 225-234). Nottingham, United Kingdom: University Press.
Uredba Komisije (EZ-a) br. 1881/2006 od 19. prosinca 2006. kojom se utvrđuju najveće dopuštene količine određenih kontaminanata u hrani.

Jelka Pleadin, Ana Vulić, Nina Perši, Mario Škrivanko, Mario Mitak, Brankica Capek, Željko Cvetnić

Contamination of food and feedingstuff from economies of eastern Croatian with aflatoxin B₁

Abstract

---

The paper presents the results of determination of the level of aflatoxin B₁ (AFB₁) levels in feed materials and feedingstuffs on a dairy farms from the eastern part of the Croatia, sampled in the first half of the 2013 after observation of milk contamination.

Survey results indicated on large amounts of AFB₁ in maize, significantly higher than the allowed level defined by legislation and the consequent contamination of feedingstuffs for dairy cattle in which production maize is used in a significant proportion. Contamination with AFB₁ can be linked to weather conditions during the period of maize growth and harvest in 2012 which with high temperatures and low rainfall favored AFB₁ production. Insufficient cure and some other factors also could facilitate the formation of this toxin during storage. In order to prevent adverse effects of AFB₁ on animal and human health, and also to reduce losses in agricultural production, systematic monitoring and further investigations of feed materials and feedingstuffs contamination is very important.

---

Key words: aflatoxin B₁, feed materials, feedingstuffs, contamination, Eastern Croatia

---