Nina Bilandžić, Blaženka Kos, Jagoda Šušković, Marija Vrebac, Božica Solomun Kolanović i Ines Varga
Dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, dipl. ing. biotehnol., Ines VARGA, mag. primj. kem., Hrvatski veterinarski institut, Zagreb; dr. sc. Blaženka KOS, dipl. ing. biotehnol., redovita profesorica, dr. sc. Jagoda ŠUŠKOVIĆ, dipl. ing. biotehnol., redovita profesorica, Marija VREBAC, mag. ing. biotehnol., Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Zagreb
UvodMaterijali i metodeRezultati i raspravaSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
Kao najčešća bolest muznih životinja u suvremenoj intenzivnoj proizvodnji mlijeka javlja se upala mliječne žlijezde, mastitis. Muznim kravama lijekovi se primjenjuju intramamarno, parenteralno, intravaginalno ili dodatkom stočnoj hrani, a nepravilna uporaba lijekova u kontroli mastitisa je glavni izvor pojave ostataka lijekova u mlijeku (Popelka i sur., 2004.). Primjena fluorokinolonskog antibiotika flumekina je raširena u tretiranju mastitisa (Sarkozy, 2001.).
Određivanje rezidua antimikrobnih lijekova, odnosno njihova kontrola u mlijeku je od velike važnosti za mljekarsku industriju, odnosno za spriječavanje njihova ulaska u prehrambeni lanac (Mitchell i sur., 1998.).
Razvijeno je niz orijentacijskih metoda kojima je omogućena brza detekcija antimikrobnih lijekova u mlijeku, uključujući mikrobiološke metode te različite imunološke metode (Scortichini i sur., 2009., Kos, 2011.). Imunoenzimski testovi kao npr. ELISA (engl. enzyme-linked immunosorbent assay) i EIA (engl. enzyme immunoassay), su imunološke metode često korištene za detekciju rezidua veterinarskih lijekova u životinjama i proizvodima životinjskog podrijetla zbog svoje visoke osjetljivosti, jednostavnosti i mogućnosti istovremene analize velikog broja uzoraka malog volumena (Scortichini i sur., 2009.).
Za detekciju rezidua kinolona također je opisano nekoliko imunoenzimskih tehnika (Bucknall i sur., 2003., Van Collie i sur., 2004.).
U cilju zaštite zdravlja potrošača, Europska unija utvrdila je za flumekin u mlijeku najvišu dopuštenu količinu ostataka (NDK) od 50 mg/kg (EC, 2010.). Cilj ove studije bio je ispitati ostatke flumekina u uzorcima mlijeka prikupljenih po cijelom području Republike Hrvatske u 2014. godini.
Za analizu flumekina korištena je orijentacijska metoda validirana prema Odluci Komisije 2002/657/EC (EC, 2002.).
Materijali i metode
-
Prikupljanje uzoraka
Ukupno 130 uzoraka mlijeka prikupljeno je s farmi muznih krava i malih gazdinstava diljem Hrvatske tijekom 2014. godine. Nakon prikupljanja, uzorci su pohranjeni u polietilenske posude, označeni i smrznuti na -18 °C do analize.
-
Reagensi i standardi
Za određivanje flumekina korišten je ELISA kit proizvođača Euro-Proxima (Arnhem, Nizozemska). Kit se sastoji od: mikrotitarske ploče (96 jažica), pufera za razrijeđivanje (spremno za uporabu), pufer za ispiranje (20x koncentriran), otopine supstrata (spremno za uporabu), stop otopine (spremno za uporabu), enzim-konjugata (liofilizirani), antitijela (liofilizirano), otopine standarda (0, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 i 100 ng/mL).
Metanol je nabavljen od Carlo Erba (Milano, Italija). Ultra čista voda je pripremljena koristeći sustav Direct Q 5UV (Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka). Bazne otopine standarda pripremljene su otapanjem analita u metanolu. Radne otopine upotrebljavane za obogaćivanje slijepih uzoraka dobivene su daljnim razrjeđivanjem, koristeći isto otapalo do koncentracije od 1 μg/mL. Bazne i radne otopine standarda su pohranjene na +2 to +8 °C.
-
Instrumenti
U pripremi uzorka korišteni su slijedeći instrumenti: homogenizator Ultra-Turrax® model T25IKA®, Vortex model VWR, VX-2500 (IKA® -WERKE GMBH & CO.KG, Njemačka) i centrifuga ROTANTA 460 R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Njemačka). Optička gustoća je mjerena pomoću spektrofotometra, mikročitača Tecan model Sunrise Absorbance Reader (Tecan, Austria GmbH, Salzburg, Austrija).
-
Priprema uzorka
Pipetirano je 0,5 mL homogeniziranog mlijeka u čistu epruvetu te dodano 4,5 mL 8% metanola u puferu za razrjeđenje uzorka i vorteksirano 30 min. Centrifugirano je 10 min na 2000 × g. Otpipetirano je 100 μL vodenog dijela ispod masnog sloja u čistu epruvetu i dodano 900 μL 8% metanola u puferu za razrjeđenje uzorka. Dobro je promiješano i pipetiran je alikvot od 50 μL u jažice.
-
Postupak ELISA testa
Test je proveden prema uputama proizvođača Euro-Proxima. Apsorbancija je mjerena pri 450 nm, uporabom spektrofotometra za ELISA mikrotitarske pločice.
-
Validacija metode
Postupak validacije metode za određivanje flumekina u uzorcima mlijeka proveden je prema kriterijima za orijentacijske metode sukladno Odluci Komisije 2002/657/EC (EC, 2002.).
U tu svrhu, određeni su osnovni parametri: sposobnost dokazivanja CCβ, granica detekcije LOD, granica kvantifikacije LOQ i iskorištenje.
Granica detekcije LOD i granica kvantifikacije LOQ izračunati su nakon analiziranja 20 negativnih uzoraka, odnosno tako da se srednjoj vrijednosti ponavljanih uzoraka pribroji 3 (LOD), odnosno 10 (LOQ) standardnih devijacija uzoraka. Granična koncentracija CCα određena je kao zbroj srednje vrijednosti koncentracije slijepih uzoraka i standardne devijacije odgovora slijepih uzoraka pomnožene s 2. Sposobnost dokazivanja CCβ (β = 5%) je dobivena kao zbroj granične koncentracije i odgovarajuće standardne devijacije pomnožene s 1,64. Iskorištenje je određeno obogaćivanjem slijepih uzoraka mlijeka na četiri razine: 25, 50, 80 i 100 mg/kg.
-
Statistička analiza
Statistička analiza je provedena računalnim programom Statistica 6,1 (StatSoft Inc., Tulsa, SAD). Koncentracije flumekina su izražene kao minimalna i maksimalna koncentracija, srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD).
Rezultati i rasprava
Ostatci antibiotika u sirovom mlijeku mogu izazvati znatne gubitke u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda zbog inhibicije bakterijskih starter kultura odgovornih za fermentaciju. Stoga je važno izbjeći prisutnost ostataka antibiotika u mlijeku u svrhu smanjenja problema u proizvodnji i sprječavanja izloženosti potrošača njihovom djelovanju (Molina i sur., 2003.). Kinolone karakterizira dobra oralna apsorpcija i raspodjela u tkivu organizma. Međutim, fluorokinoloni, među koje se ubraja i flumekin, kao tvari s kelatnim svojstvima, mogu imati negativan učinak na spermatogenezu i u trudnica prouzročiti pobačaj (Sepčić i sur., 2009.). Utvrđeno je također da dugotrajna izloženost niskim koncentracijama kinolona može imati negativne učinke na gustoću kostiju. Prisutnost rezidua kinolonskih antibiotika u mlijeku, osim što može dovesti do zdravstvenih problema, može prouzročiti razvoj antibiotičke rezistencije kod crijevnih bakterija (Steffenak i sur., 1993., Zayas-Blanco i sur., 2004.).
U ovom radu ostatci flumekina su određivani ELISA metodom, validiranom prema kriterijima postavljenim Odlukom komisije 2002/657/EC (EC, 2002.).
Pri tome je u samo dva uzorka mlijeka koncentracija flumekina bila iznad LOQ vrijednosti od 26,0 mg/L.
Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) je na temelju istraživanja hepatotoksičnosti flumekina u mužjaka miševa utvrdila prihvatljiv dnevni unos (ADI, Acceptable Daily Intake) od 30 mg/kg tjelesne težine (WHO, 2004.). Ako se uzme u obzir da je srednja potrošnja mlijeka odraslih osoba u Hrvatskoj 300 mL te da prosječna osoba ima oko 60 kilograma tjelesne težine, može se provesti procjena dnevnog unosa flumekina (Antonić Degač i Kaić-Rak 2007.). Uvrštavanjem dobivene srednje vrijednosti, izračunata procjena dnevnog unosa flumekina iznosi svega 0,062 mg/kg tj. težine po danu te je značajno niža u odnosu na prihvatljivi dnevni unos od 30 mg/kg tj. težine po danu.
U prijašnjem istraživanju određivanja koncentracija različitih veterinarskih lijekova (kloramfenikol, sulfonamid, tetraciklin, gentamicin, streptomicin, dihidrostreptomicin, flumekin i enrofloksacin) u mlijeku u Hrvatskoj utvrđena je slična srednja vrijednost flumekina od 10,4 mg/L (Bilandžić i sur., 2011.). Također, u nedavnim istraživanjima provedenim u Španjolskoj kao i Turskoj nisu utvrđene povišene koncentracije kinolona u mlijeku (Zafra Gomez i sur., 2008., Nizamlioğlu i Aydın, 2012.)
Međutim, studije utvrđivanja ostataka kinolonskih antibiotika u mesu su pokazale prisutnost ovih spojeva.
Tako je u Turskoj u 34% uzoraka kokošje jetre utvrđeno da sadrže ostake kinolona (ciprofloksacin, enrofloksacin, marbofloksacin, danofloksacin, difloksacin, flumekin, sarafloksacin i oksolinska kiselina) (Nizamlıoğlu i Aydın, 2012.), a u Saudijskoj Arabiji je u 35% mišićnog tkiva i 56,7% uzoraka jetre kokoši utvrđena prisutnost rezidua norfloksacina (Al-Mustafa i Al-Ghamdi, 2000.). U Dominikanskoj Republici je 6,25 do 50% uzoraka pilećih prsa sadržavalo ostatke kinolona u koncentraciji iznad NDK vrijednosti (Silfrany i sur., 2013.), a u Iranu je u 8,88% mišićnih tkiva, 13,33% jetri i 24,44% uzoraka bubrega određena koncentracija enrofloksacina iznad NDK vrijednosti (Salehzadeh i sur., 2007.).
U svrhu zaštite krajnjih potrošača i sprječavanja širenja antibiotičke rezistencije vrlo je važna kontrola ostataka antibiotika u mlijeku. Dobivene koncentracije flumekina u ovome radu su ispod dopuštene NDK vrijednosti te pokazuju da mlijeko u Hrvatskoj sadrži niske razine ostataka flumekina te se može smatrati zdravstveno ispravno za primjenu u prehrani.
Sažetak
Kinolonski antibiotici uključuju sintetske antimikrobne lijekove širokog spektra, kao što su flumekin, enrofloksacin, ciprofloksacin, norfloksacin, marbofloksacin, danofloksacin i drugi. Ova važna skupina antibiotika naširoko se koristi u liječenju bolesti stoke, kao što su infekcije probavnog i respiratornog trakta.
Postoje dokazi da dugotrajna izloženost niskim koncentracijama tih tvari može imati negativne učinke na mineralnu gustoću kostiju u djece i trudnica. Prisutnost kinolonskih ostataka u mlijeku također dovodi do javnozdravstvenih problema zbog razvoja rezistencije na lijekove kod crijevnih bakterija. U cilju zaštite zdravlja potrošača, Europska unija utvrdila je za flumekin u mlijeku najvišu dopuštenu količinu (NDK) od 50 mg/L. Za određivanje ostataka flumekina u mlijeku korištena je orijentacijska imunoenzimska metoda (ELISA) validirana prema Odluci Komisije 2002/657/EC. Dobiveni su parametri validacije koji ispunjavaju zadane kriterije za utvrđivanje flumekina u uzorcima mlijeka: LOD, granica detekcije 10,2 mg/L; LOQ, granica kvantifikacije 26,0 mg/L; CCβ, sposobnost dokazivanja 42,3 mg/L; iskorištenje 93,7%. Tijekom 2014. godine ukupno 130 uzoraka mlijeka je analizirano na ostatke flumekina. Koncentracije flumekina kretale su se u rasponu od 1,38 do 32,6 mg/L sa srednjom koncentracijom od 12,3 mg/L. Samo dva uzorka mlijeka imala su vrijednosti iznad granice kvantifikacije 26,0 mg/L. Zaključno, dobiveni rezultati kontrole flumekina ukazuju da mlijeko sadrži niske razine ostataka flumekina, ispod dopuštene NDK vrijednosti i stoga je sigurno za konzumaciju.
Literatura [… prikaži]
Control of Flumequine Residues in Milk Samples
Nina BILANDŽIĆ, Grad. Biotechnol. Eng., PhD, Scientific Advisor, Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, Grad. Biotechnol. Eng., Ines VARGA, Mag. Appl. Chem., Croatian Veterinary Institute, Zagreb; Blaženka KOS, Grad. Biotechnol. Eng., PhD, Full Professor, Jagoda ŠUŠKOVIĆ, Grad. Biotechnol. Eng., PhD, Full Professor, Marija VREBAC, Mag. Biotechnol. Eng., Faculty of Food Technology and Biotechnology, Zagreb
Quinolones include synthetic broad-spectrum antimicrobials, such as flumequine, enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, marbofloxacin, danofloxacin, and others.
This important group of antibiotics is widely used in the treatment of animal diseases, such as infections of the digestive and respiratory tracts. There is evidence that long-term exposure to low concentrations of these substances can have adverse effects on bone mineral density in children and pregnant women. The presence of quinolone residues in milk is also a public health issue due to the development of drug resistance in populations of intestinal bacteria. In order to protect consumer health, the European Union has established Maximum Residue Levels (MRLs) for flumequine in milk of 50 μg/L.
For the determination of flumequine residues in milk, the screening immunoenzymatic method (ELISA) validated according to Commission Decision 2002/657/EC was used.
The result of the validation parameters met the criteria for determination of flumequine in milk samples: LOD (limit of detection) 10.2 μg/L; LOQ (limit of quantification) 26.0 μg/L; CCß (detection capability) 42.3 μg/L; recovery 93.7%. During 2014, a total of 130 milk samples were analyzed for flumequine residues. Flumequine concentrations were in the range from 1.38 to 32.6 μg/L with a mean concentration of 12.3 μg/L. Only two milk samples had values above the limit of quantification of 26.0 μg/L. In conclusion, the results of flumequine control indicate that milk contains low levels of flumequine residues that are below the permitted maximum levels and therefore is safe for human consumption.
