T. Keros, Lorena Jemeršić, J. Prpić, D. Brnić, Ž. Cvetnić i M. Lojkić
Dr. sc. Tomislav KEROS, dr. med. vet., znanstveni suradnik, dr. sc. Lorena JEMERŠIĆ, dr. med. vet., naslovna docentica, znanstvena savjetnica, dr. sc. Jelena PRPIĆ, dipl. mol. biol., viša asistentica, dr. sc. Dragan BRNIĆ, dr. med. vet., viši asistent, dr. sc. Željko CVETNIĆ, dr. med. vet., naslovni izvanredni profesor, znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, dr. sc. Mirko LOJKIĆ dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni izvanredni profesor u mirovini, Zagreb
„Molekularna biologija rubno je područje, u kojem fizičari i kemičari surađuju s biolozima“ (Worren Weaver, 1938.)
Preuzeto: “Stanica – Molekularni pristup III izdanje“(Cooper i sur.), Medicinska naklada Zagreb, 2004.
Američki genetičari George W. Beadle i Edvard L. Tatum potom su godine 1945. prepoznali da svaki pojedini gen nosi zapis za tvorbu samo jednog proteina.
Alfred Hershey i Martha Chase su 1952. godine pokazali da se pri prodoru virusa u bakterije unose samo molekule viralne DNK, a u bakteriji se razmnoži mnoštvo novih virusa, a time je dokazan kemijski prijenos nasljeđa putem DNK (Delić, 1997.).
Maurice Hugh Wilkins sa suradnicima te Rosalind Franklins i R. G. Gosling godine 1953. rentgenskom su difrakcijom X zraka proučavali kristalografsku strukturu djelomično dehidrirane i kristalične molekule DNK te su pokazali da je svaki polinukleotidni lanac poput zavojnice svijen oko središnje osi (Franklin i Gosling, 1953.,Wilkins i sur., 1953.).
Načinili su trodimenzijski strukturni model DNK, u kojemu je DNK makromolekula koja prenosi nasljedna svojstva, a tvore je genski biljezi (kodovi) s četiri nukleotidne baze u osnovi kojih su postrano pridodani ugljikohidrati s pet ugljikovih atoma (pentoza) i fosfatna skupina. Pri tome su dvije baze purinske: adenin (A) i guanin (G), a dvije su baze pirimidinske: citozin (C) i timin (T). Parovi četiriju dušičnih baza: adenina (A), gvanina (G), timina (T) i citozina (C), poredani i povezani poput dvostruke zavojnice nalik na ljestve (engl. ladder) kojih prečke (engl. rungs) tvore parovi baza spojeni vodikovim vezama, i to adenin s timinom i guanin s citozinom. Prigodom stanične diobe pojedina se zavojita molekula DNK (engl. helix) uzdužno podijeli i razdvoje se parovi baza te se baze svake polovice zavojnice vežu sa sukladnom slobodnom bazom u parove istovjetne onim izvornim.
Izloženim je otkrićem razriješeno pitanje prijenosa DNK u svakoj diobi stanica i može se protumačiti kako se poruke pohranjene u DNK molekuli prenose nastalim novim stanicama te staničnim organelama što proizvode proteine (Watson i Crick, 1953., Nussbaum i sur., 2004.).
Američki je biokemičar Arthur Kornberg godine 1956. u ekstraktu bakterije Escherichia coli uspio proizvesti DNK u kušalici (in vitro). On je miješao segmente DNK s pojedinim enzimima pa ih je dodao matrici prirodne DNK i segmenti su se DNK spojili u lanac istovjetan matrici DNK. Enzim DNK polimeraza I koji pri tome katalizira fosfodiestersko povezivanje nukleotida u smjeru 5 ’ – 3 , nazvan je Kornbergov enzim, koji prepoznaje pentoza-fosfatni dio molekule pa se može odrediti specifični redoslijed dušičnih baza. Po tome su iz E. coli izolirane još i DNK polimeraza II te u polimerizaciji najvažnija DNK polimeraza III (Kornberg i Baker, 1992.). Matthew Meselson i Frank Stahl su 1958. godine otkriću Watsona i Cricka pridodali tzv. model semikonzervativne sinteze prema kojemu su obje nove molekule DNK „hibridi“ izvornog i novostvorenog lanca. U daljnjem se uzgoju povećava broj lakših molekula DNK i naposljetku redovito osim dva hibrida nalazimo i dva nova nukleotidna lanca uz očuvanje roditeljskih polinukleotida u molekulama potomaka (Nussbaum i sur., 2004.).
Molekularni su biolozi temeljem sveukupnih istraživanja izložili dvije glavne postavke molekularne biologije: genski zapis i središnji zakon. Genski zapis (engl. Genetic code) navodi da poredak baza određuje poruke za tvorbu specifičnih proteina, odnosno gena, a pri tome pojedina molekula DNK može sadržavati tisuće gena. Središnji zakon (engl. Central dogma) upućuje na to da DNK poruke za tvorbu proteina otprema putem ribonukleinske kiseline (RNK), i to redoslijedom mRNK, rRNK, tRNK (Crick, 1970.).
Američki su biokemičari Marshall W. Nirenberg i Heinrich J. Matthaei godine 1961. otkrili kod za aminokiselinu fenilalanin, a potom su njihovi sljedbenici otkrili genske kodove dvadeset aminokiselina uključenih u tvorbu proteina te su naposljetku prepoznali i kako nastaju RNK kopije DNK koda.
Marshall W. Nirenberg i Gobind Har Khorana uključujući i druge znanstvenike uspjeli su štoviše pokazati da je genski zapis trodijelni sklop baznih spojeva (engl. triplet), primjerice AAT, AAC, a svaki oblikuje različiti dio proteina. Tripleti pak ne nastaju izravno iz DNK, nego RNK posredstvom srodne joj molekule koja najprije dekodira odsječke, a potom RNK segmenti ostvaruju tvorbu proteina (Nirenberg i Khorana, 1961.).
Iste godine su Sidney Brenner, Francois Jacobi Matthew Meselson inficirajući E. coli bakteriofagom pokazali udio glasničke ribonukleinske kiseline (mRNK) kao kalupa za sintezu bjelančevina kataliziranu enzimom RNK polimeraza (Brenner i sur., 1961.).
Američki biolog Carles Yanofsky sa suradnicima je 1964. godine istraživanjima genskih mutacija u bakterije E. coli pokazao da poredak nukleotida u molekulama DNK uvjetuje redoslijed aminokiselina u bjelančevinama.
Roger D. Kornberg je 1974. godine istražio i mehanizam sažimanja kromatina, odnosno ustrojstvo nukleosoma sa sljedovima DNK što okružuju histone, a potom je razradio i prikaz prijetvorbe genskih zapisa u molekule tRNK (Cooper i Hausman, 2004.).
Dugo je vremena bilo znano da se istovrsni genski zapisi mogu nalaziti u različitim dijelovima molekule DNK te da mnogi dijelovi DNK ne ostvaruju genske ekspresije. No, tek se godine 1977. radovima Richarda Robertsa i Philippa Sharpa spoznalo da dugačku molekulu DNK čine informacijski značajni sljedovi, egzoni, koji su međusobno odijeljeni informacijski beznačajnim odsječcima nazvanim introni.
David Botstein je sa suradnicima još 1980. godine dokazao opstojanje malih varijacija u genskom materijalu pojedinih ljudi te da nova vrsta genskih biljega nazvana polimorfizam duljine restrikcijskog ulomka (engl. Restriction Fragment Lenght Polymorphism – RFLP), može poslužiti u sastavljanju mape polimorfnih biljega za genetsku analizu (Goldstein i Schlötterer, 1999.).
Alec J. Jeffreys i suradnici su godine 1985. objavili ključnu raspravu o minisatelitima, sljedovima ograničene duljine opetovanja i po prvi put je sustav pretraživanja više lokusa (engl. MultiLocus Probe – MLP) primijenjenu DNK analizi pa danas govorimo i o DNK otisku (engl. finger-print) (Jeffreys, 1993., Primorac i sur., 2008.).
Yusuke Nakamura i suradnici su potom 1987. godine otkrili i postojanje više mikrosatelita koje su nazvali lokusima promjenjiva broja opetujućih sljedova (engl. Variable Number of Tandem Repeats – VNTR) (Nakamura i sur., 1987.).
Karry Banks Mullis je iste 1987. godine usavršio postupak DNK umnožavanja, odnosno replikacije u masi genske skupine. Pri tome se primjenom pojedinih supstanci količina DNK povećava upravo razmjerno količini bakterijske DNK. Mullis je otkrićem lančane reakcije polimerazom (engl. Polymerase Chain Reaction – PCR), omogućio i analizu bioloških uzoraka s neznatnom količinom DNK, jer se tim postupkom u nekoliko sati lanac DNK ili njegovi dijelovi mogu umnožiti milijarde puta (Mullis i Faloona, 1987., Madić, 1993.).
Naziv mikrosateliti u literaturu su 1990.-ih godina uveli J. L. Weber i P. E. May te R. Roberts, a u prvo se vrijeme taj naziv rabio samo za opetovanje kratkih CA/GT dinukleotidnih sklopova (engl. motifs) uz različite druge nazive za uzastopno opetovanje dvojnih sljedova (engl. Tandemly Repeats) uključujući jedinična (engl. Simple Sequences) i kratka tandemska opetovanja (engl. Short Tandem Repeats – STR). Danas je naziv mikrosateliti općenito usvojen za sve sljedove u kojima se opetuju kratki sklopovi uključujući minisatelite i skrovite jednostavne odsječke (engl. Crytically Simple Regions).
Pri tome se mikrosateliti definiraju kao sljedovi ne dulji od šest nukleotidnih baza koji se tandemski opetuju bez prekidanja (interrupcije) nekim drugim sklopom (Weber i May, 1989., Ivanković, 2005.).
Peter Kunzler 1995. i Yechezkel Kashisu su 1997. godine štoviše ukazali da mikrosatelitski sljedovi imaju funkcijsku zadaću kodirajućih ili regulacijskih elemenata te se nalaze na začetcima promotivnih odsječaka (engl. Promoterregions). Istodobno se pokazalo da mikrosateliti sudjeluju u vezanju proteina što je pak zadaća začetnih aktivirajućih sljedova (engl. upstream). Daljnja pak istraživanja upućuju da su sposobnost vezanja proteina i potencijalni učinak mikrosatelita uvjetovani brojem rendomskih opetovanja u specifičnim mikrosatelitskim prostorima (Kunzler i sur, 1995., Kashi i sur., 1997.).
U drugoj je polovici dvadesetoga stoljeća pozornost genetičara bila jednako pregalački usmjerena mogućnostima preraspoređivanja pa i presađivanja genetskog materijala, odnosno tehnologiji rekombiniranja DNK.
Nakon pionirskih istraživanja Barbare McClintoc 1956. godine o mobilnim genskim elementima (engl. transposible elements) i sposobnosti gena da mijenjaju položaj u kromosomu, Robin Holliday je razradio postupak rezanja pojedinih lanaca dviju molekula DNK te ukriženog spajanja njihovih presječenih krajeva, pa danas govorimo o začetnom modelu rekombinacije DNK (McClintock, 1956., Holliday, 1964.).
Švicarski znanstvenik Werner Arber te američki istraživači Hamilton O. Smith i Daniel Nathans su godine 1970. razmatrali mogućnost isijecanja specifičnih sljedova iz molekula DNK primjenom ograničavajućih enzima (engl. restriction endonucleases) i time su ostvarili mogućnost istraživanja u području rekombiniranja molekula DNK.
Derek Bromhall je potom uspješnim presađivanjem stanične jezgre u jajnu stanicu otvorio područje kloniranja stanica, a C. Merril, M. Geier i J. Petricciani su 1971. godine u Bethesdi dokazali da geni uneseni iz filogenetski udaljenog organizma u citoplazmi novoga domaćina ostvaruju tvorbu bjelančevine kodirane unesenom genetskom porukom (Delić, 1997.).
Stanley Cohen i Herbert Boyer su godine 1973. unaprijedili postupak prijenosa gena uporabivši plazmide, vrlo malene bakterijske kružne molekule DNK na granici kemijskoga spoja i virusa.
Znanstvenicima je to otkriće omogućilo odjeljivanje gena te i prikupljanje dostatne količine gena za istraživanja.
Frederic Sanger u Cambridgeu i Walter Gilbert u Harvardu 1977. godine su ostvarili kemijsko cijepanje i zaustavljanje sinteze lanca DNK čime je omogućeno sekvenciranje dušičnih baza A, T, G, S ispravnim redoslijedom (Sanger, 1981., Cooper i Hausman, 2004.).
Američki istraživač Paul Berg sa suradnicima i brojni znanstvenici naposljetku su 1980.-ih godina razradili mogućnosti premještanja pojedinih gena iz jedne jedinke u drugu jedinku te govorimo o genetičkom inženjerstvu (Berg, 1981.).
Genetičko inženjerstvo je tijekom posljednjih triju desetljeća omogućilo znanstvenicima potanja istraživanja genske strukture i djelatnosti u stanicama viših biljaka i životinja, što je u mnogome pridonijelo razumijevanju brojnih bioloških zbivanja i naposljetku je omogućilo projekt od čitanja ljudskoga genoma. Nagli razvoj molekularne genetike i pogotovo pojava nove generacije vektora za kloniranje gena, uporaba strateških oligonukleotida te automatizacija i kompjuterizacija postupaka omogućili su da se danas sekvenciranjem molekula DNK tijekom 24 sata može odrediti i do 192.000 nukleotida.
Golemi je napredak tehničkih znanosti, posebice računalne tehnologije omogućio brz i velik prodor u prirodne tajne. Napori su znanstvenika udruženi pa je 1989. godine započet divovski projekt „Ljudski genom“ (The Human Genom Project – HGP). Istodobno se u medicini uznastojalo uskladiti nazivlje DNK biljega pa je godine 1997. u Sjedinjenim Američkim Državama započela izradba združene zbirke DNK podataka (Combined DNA Index System – DADIS).
Naposljetku je udruga International Human Genome Sequencing Consortium – IHGSC pod vodstvom Francis S. Collinsa godine 2001. dovršila istraživanje u kojemu je sudjelovalo tisuće znanstvenika iz vodećih američkih, kanadskih, britanskih njemačkih, francuskih, japanskih i kineskih laboratorija. Gotovo istodobno su i znanstvenici okupljeni oko tvrtke Celera Genomics te predvođeni Craig J. Venterom objelodanili mapu ljudskoga genoma s približno sličnim podatcima (IHGSC, 2001., Venter i sur., 2001.).
U veterinarstvu, povijest suvremenih sustavnih istraživanja rodoslovlja domaćih životinja započinje sredinom prošloga stoljeća određivanjem tipova krvnih grupa i serološkim postupcima te utvrđivanjem roditeljstva u konja, a potom i u uzgoju te registraciji goveda i drugih domaćih životinja (Caputi i sur., 1992., Ivanković i sur., 2005.).
Ističemo da su Ron J. Britten i David E. Kohne već 1968. godine, u pionirskom istraživanju ustvrdili da približno 50% genoma goveda čine odsječci DNK, a među njima je čak polovica visoko opetujućih (engl. Repetitive DNA Sequences). Uslijedili su mnogobrojni radovi, u govedarstvu M. C. Hinesa i B. Larsena, M. Georgesa i suradnika (1991.), D. Vaimana i suradnika (1992.), L. S. Brezinskya i suradnika (1993.) te mnogih ugih istraživača. A. J. Lenstra je, štoviše, još 1993. godine načinio i nomenklaturu opetujućih odsječaka DNK. Sve rečeno bilo je poticajem J. E. Womacku (1992.), i M. D. Bishopu sa suradnicima (1994.), a potom S. J. Kempu (1995.) i R. Friesu (1995.) te drugim istraživačima da uznastoje načiniti i karte različitih gena u goveda.
Naposljetku su W. Barendse, D. Vaiman te S. M. Kappes sa suradnicima godine 1997. razradili nove genomske karte preživača, a istodobno je pokazana vrijednost mikrosatelita u genetskom pretraživanju te napose značenje njihova združivanja s raspršenim jezgrinim elementima (SINE S ) u sekvestraciji i dinamici genoma (Womacki sur., 1992., Barendse i sur., 1997., Kappes i sur., 1997., Vaiman i sur., 1997., Ivanković, 2005.).
Postupak se određivanja krvnih grupa još uvijek rabi u rutinskoj dijagnostici, ali se s vremenom te pretrage zamjenjuju postupkom određivanja obilježja DNK, koji nudi učinkovitije mogućnosti genetičkih pretraživanja. Veliko se značenje pritom pridaje prepoznavanju položaja i veličine mikrosatelita, odnosno polimorfnih kratkih opetujućih sljedova DNK (STR S ), koji se nasljeđuju od obaju roditelja te je primjerice srodstvo u teleta moguće odrediti s gotovo 100%-tnom točnosti. Pretraživanjima DNK se određuju i veličine genomskih odsječaka u različitim uzorcima i više nisu ograničeni na uzimanje uzoraka krvi. U živih je životinja omogućeno uzimanje uzoraka korijena dlake, mlijeka, sjemena pa i izmeta što umanjuje stresne pojave prigodom pretraga. Za analizu pak u mrtvih životinja može se uzorak DNK uzeti iz mišića, kože, kostiju ili zuba, a mogu se identificirati i tkiva životinja koja su bila zamrznuta. Stoga se danas i u veterinarskoj medicini redovito rabi postupak lančane reakcije polimerazom (PCR), a napose kada se uzročnici kroničnih zaraznih bolesti teško mogu uzgajati in vitro ili je njihov uzgoj dugotrajan. Posljednjih se godina, štoviše, radi na stvaranju banki genetskih podataka u svim zemljama, a Međunarodna udruga za genetiku životinja (International Society of Animal Genetics – ISAG) pri određivanju roditeljstva i/ili srodstva, posebice ističe vrijednost pretraživanja DNK u uzgojnim programima te i u isključenju genetskih deformacija (Heyeni sur., 1997., Jemeršić i sur., 2003., Nussbaum i sur., 2004., Šerman i sur., 2005., Womack, 2008.).
U našem veterinarstvu, samo nekoliko godina nakon poticajnih radova Marie Luise Glowatzky-Mullis i suradnika 1995. godine te Davida W. Heyena i suradnika 1997. godine u Zagrebu je već godine 2000. osnovan i opremljen Laboratorij za mikrobiologiju i genetiku pri Hrvatskome veterinarskom institutu. Osim potvrđivanja rodoslovlja i filogenetske analize, danas je laboratorij dobro opremljen uređajima potrebnim za prepoznavanje pojedinih virusa i njihove filogenetske analize za pojedine bolesti, primjerice za klasičnu svinjsku kugu, afričku svinjsku kugu, pseudorabies, PCV-2, itd.
Danas je molekularna biologija stanice bitno područje istraživanja u osnovama svih bioloških znanosti, a napose zbog njezine sve opsežnije primjene u humanoj i veterinarskoj medicini te u agrokulturi, biotehnologiji i drugim djelatnostima.
Nova saznanja i dostignuća u razumijevanju bioloških procesa uvelike su nastala zaslugom novih znanstvenih disciplina, poput genomike, proteomike i metabolomike te već sada ostvaruju učinkovite pristupe u liječenju bolesnika pa i primjenu individualizirane terapije temeljene na analizi bolesnikova genoma.
Pripominjemo pak da je u Republici Hrvatskoj sadašnja uporaba suvremenih genomskih pristupa ograničena te bi valjalo dodatno poticati translacijske pristupe, koji bi omogućili primjenu najnovijih tehnologija u svakodnevnu kliničkom radu (Nussbaumi sur., 2004., Šerman i sur., 2005., Primorac i sur., 2008.).
Sažetak
Američki stručnjaci Oswald Theodore Avery, Colin MacLeod i Mechlin McCharty su 1944. godine istraživali pretvorbu bacila pneumonije. Ustvrdili su da prigodom umnažanja stanica samo molekule DNK sadrže genetske poruke koje determiniraju nasljeđivanje pa se danas to istraživanje smatra početkom razdoblja molekularne genetike.
U povodu obljetnice rečenog veličajnog otkrića izložen je povijesni prikaz razvoja molekularne genetike do završetka projekta ljudskog genoma, a ukratko su pridodani i najvažniji podatci o tehnologiji rekombinacije DNK. U završnom je odjeljku kratak pregled istraživanja u veterinarstvu, a naposljetku je ukazano na značenje genetskih istraživanja u veterinarskoj medicini i drugim srodnim područjima.
Literatura [… prikaži]
Short Review of the Development of Molecular Genetics
Tomislav KEROS, DVM, PhD, Senior Scientific Associate, Lorena JEMERŠIĆ, DVM, PhD, Assistant Professor, Scientific Advisor, Jelena PRPIĆ, BSc, PhD, Senior Assistant, Dragan BRNIĆ, DVM, PhD, Senior Assistant, Željko CVETNIĆ, DVM, PhD, Associate Professor, Scientific Advisor; Mirko LOJKIĆ, DVM PhD, Scientific Advisor, Associate Professor in Retirement, Zagreb
In 1944, the American scientists Oswald Theodore Avery, Colin MacLeod and Mechlin McCharty studied the transformations of the pneumonia bacillus. They proved that genetic messages were contained in the DNA molecules in chromosomes that segregated during mitosis, and that only the DNA determined hereditary characteristics.
Consequently, these studies were considered to be the beginning of the period of molecular genetics. On the occasion of the anniversary of this important discovery, the authors have decided to provide an overview of the most significant achievements until the completion of the Human Genome Project. Moreover, the article includes notable points concerning the technology of DNA recombination. The final section contains a short review of genetic research studies in veterinary medicine and other related fields.
