Izlaganje sa skupaParazitiZoonoze i Jedno zdravlje

Krpelji Dalmacije i njihov vektorski potencijal

Relja Beck¹, Sanja Bosnić¹, Renata Brezak¹, Tomislav Šarić², Antun Kostelić³, Ivana Lohman Janković4
1 Laboratorij za parazitologiju, Odjel za bakteriologiju i parazitologiju, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, 2 Odjel za ekologiju, agronomiju i akvakulturu, Sveučilište u Zadru, Zadar, 3 Zavod za opće stočarstvo, Agronomski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, 4 Uprava za Veterinarstvo i sigurnost hrane, Ministarstvo poljoprivrede, Zagreb

Izvor: Zbornik radova 6. HRVATSKI VETERINARSKI KONGRES

Sažetak


Krpelji su, nakon komaraca, najvažniji vektori bolesti ljudi i životinja u svijetu dok su u Europi najznačajni prenositelji brojnih uzročnika bolesti. Detaljna i sustavna istraživanja vrsta krpelja i uzročnika bolesti koje prenose nisu provedena gotovo 50 godina u Republici Hrvatskoj. U ovom istraživanju analizirana su 192 krpelja prikupljena iz okoliša i sa životinja iz Dalmacije sa ciljem dokazivanja vrste krpelja te zoonotskih uzročnika koje mogu prenijeti. Prisutnost uzročnika u krpeljima je istraživana lančanom reakcijom polimerazom i neposrednim sekvenciranjem te su dokazane rikecije Rickettsia masillae i R. aeshlimanii iz skupine pjegavih groznica.

Morfološkom determinacijom 192 krpelja dokazane su: Hyalomma marginatum (32), Hyalomma scupense (4), Dermacentor marginatus (4), Ixodes ricinus (5), Rhipicephalus bursa (43), Rhipicephalus sanguineus (56) i Rhipicephalus turanicus (48). Sekvenciranjem 16SrRNA potvrđene su sve vrste osim R. sanguineus, stoga se dovodi u pitanje postojanje R. sanguineus u Hrvatskoj, a sami rezultati su u suglasju sa novim istraživanjima koji ovog krpelja svrstavaju u skupinu Rhipecpahalus sanguineus sensu lato.


Ključne riječi: krpelji, molekularna, Dalmacija, Rickettsia masillae, R. aeshlimanii

Uvod


Vektorima prenosive bolesti predstavljaju emergentnu skupinu bolesti kako u Europi tako i cijelom svijetu. Krpelji su, nakon komaraca, najvažniji vektori bolesti ljudi i životinja u svijetu dok su u Europi najznačajni prenositelji brojnih uzročnika bolesti. Ne prenose svi krpelji sve patogene već postoji “specijaliziranost” pojedinih mikroorganizama prema pojedinim vrstama krpelja kojih je danas opisano 907 vrsta. U Republici Hrvatskoj dobro su poznate dvije zoonoze prenosive krpeljem Ixodes ricinus: borelioza (Lajmska bolest), uzrokovana bakterijom Borrelia burgdorferi sensu lato i krpeljni encafalitis uzrokovan istoimenim virusom.

Obje bolesti dominiraju kontinentalnom Hrvatskom, a istraživanja krpelja i zoonotskih uzročnika koje prenose u Dalmaciji nisu dovoljno istražena. Krpeljima prenosive rikecioze uzrokovane su intracelularnim bakterijama koje pripadaju skupini uzročnika pjegave groznice (SFG) ili tifus groznice (TG).
Rikecijske bolesti dokazane u Europi, uključuju mediteransku pjegavu groznicu (MSF Mediteranean spotted fever), TIBOLA (tick borne lymphadenopathy), DEBONEL (Dermacentorborne necrosis erythema lymphanedopathy) i rikecioze povezane sa limphangitisom (Lymphangitis associated rickettsiosis, LAR) (Parola i sur., 2013).

Do sada su dokazane rikecije Rickettsia conorii i R. aeshlimani u ljudi i /ili krpelja iz Dalmacije od kojih prva uzrokuju mediteransku pjegavu groznicu (Đelalija i sur., 2000; Đelalija i sur., 2007). Kako bi se popunila praznina u poznavanju vrsta kreplja i zoonotskih uzročnika koje prenose prikupljeni su krpelji iz okoliša i sa različitih vrsta životinja u različitim dijelovima Dalamcije.

Materijal i metode


Krpelji su prikupljani iz okoliša metodama “flaging“ i “draging”, uz korišenje bijelih flanelnih plahti veličine 1×1 metar. Plahte su se detaljno pregledavale nakon povlačenja svakih 4-5 metara kako ne bi promakli krpelji. Ovim metodama je bilo moguće uhvatiti i ličinke i nimfe. Uzorci su prikupljani u Konavlima, Župi Dubrovačkoj, Dubrovniku (Bosanka), Pelješcu (Kuna), okolica Metkovića (Glušci), Solinu, Sinju i okolici, Zadru te sa otoka Hvara, Paga i Dugog Otoka (Telašćica). Krpelji su potom fotografirani Stero-mikroskopom Zeiss V20 uz korištenje programa Axio Vision. DNA od 192 krpelja je izdvojena pojedinačno kitom za izdvajanje DNA, RNA i proteina iz insekata NucleoSpin DNA Insect (Macherey-Nagel, Njemačka). Po izdvajanju DNA je pohranjena na -21°C do analize. Uzorci su pretraženi na prisutnost vrsta iz rodova Babesia, Anaplasma/Ehrlichia, Borrelia te Rickettsia lanačanom rakcijom polimerazom (engl. PCR, polymerase chain reaction) i neposrednim sekvenciranjem umnoženih odsječaka. Umnažan je odsječak 18S rRNA gena babezija parom početnica BAB F 5’- CCCTTCATCGGTGGTAACTT-3’ i stražnje početnice BAB R 5’-GTGGCCACCACTCCCGTGCC-3 (BECK i sur., 2009).

Anaplazme i erlihije su dokazivane početnicama kojima se umnaža odsječak 16S rRNA gena degeneriranim početnicama EHR16SR 5’-TAGCACTCATCGTTTACAGC-3’ i EHR16SD 5’- GGTACCYACA GAAGAAGTCC-3’ (Parola i sur., 2000). Za dokazivanje rikecija umnažan je odsječak rOmpA gena uzvodnom početnicom Rr190-701 5’- GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-3’ i nizvodnom početnicom Rr190-701 5’- ATGGCGAATATTTCTCCAAAA-3’(Roux i sur.) dok je prisutnost borelija istraživana „nested“ protokolom početnicama RIS1; 5’-CTG CGA GTT CGC GGG AGA-3’ i RIS3; 5’-GGAGAG TAG GTT ATT GCC AGG-3’ u prvoj reakciji. U drugoj reakciji korišten je par početnica RIS2; 5’-TCCTAG GCA TTC ACC ATA-30 i RIS4; 5’-GAC TCT TAT TAC TTT GAC C-30. Krepljna DNA je analazirana početnicama 5’- CTG CTC AAT GAT TTT TTA AAT TGC TGT GG- 3’5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC AAG T3’ kojima se umnaža odsječak 16SrRNA gena (Black i Piesman, 1994).

U reakcijama umnažanja je korišten GoTaq G2 HotStart mastermix (Promega), početnice koncentracije 10 mol/μl, te 2 μl ranije izdvojene DNA.
Uspješnost umnožavanja je kapilarnom elektroforezom QIAEXCEL-om (Qiagen, Hilden, Germany). Uspješno umnoženi uzorci pročišćeni su pomoću ExoSAP-IT CLEAN UP (USB, SAD), prema uputama proizvođača. Rezultati određivanja nukleotidnih sljedova obrađeni su pomoću računalnog programa Lasergene (DNASTAR, Madison WI, USA) s pripadajućim potprogramima SeqMan i EditSeq. Dobiveni nukleotidni sljedovi su poravnani računalnim potprogramom Seqman i uspoređeni sa poznatim nukleotidnim sljedovima u banci gena (BLAST).

Rezultati


Nakon morfološke determinacije prema ključevima (Estrada Pena i sur.) dokazane su vrste: Hyalomma marginatum (32), Hyalomma scupense (4), Dermacentor marginatus (4), Ixodes ricinus (5), Rhipicephalus bursa (43), Rhipicephalus sanguineus (56) i Rhipicephalus turanicus (48).

Svi krpelji su pojedinačno analizirani sekvencioniranjem umnoženih odsječaka 16SrRNA te su potvrđene sve vrste osim R. sanguineus. Usporedbom dostupnih sekvenci krpelja u bazi gena GenBank morfološki determiniranih kao Rhipicephalus sanguineus podudaranje je iznosilo 99% sa sekvencama R. sanguineus. Razlike u umnoženom odsječku od oko 450 parova baza je iznosila tri nukleotide. Preostale vrste potvrđene sekvenciranjem pokazale su razlike u jednoj bazi nukleotidnih sljedova vrste Ixodes ricinus iz okolice Sinja i Paga nakon usporedbe sa dostupnim sekvencama u bazi gena GenBank.

U pojedinačno analiziranih krpelja dokazane su zoonotske rikecije R. masillae i R. aeshlimani (Beati i sur.). Sekvence su pokazale 100%-tnu jednakost sa dostupnim sekvencama iz NCBI baze. Rickettsia masillae je bila dokazana u krpelja Rhipicephalus sp., dok je R. aeshlimani bila prisutna u krpelja Hyalomma marginatum. Inficirani krpelji sa rikecijom R. masillae su bili sa područja Dubrovnika, Benkovca, Kune (Pelješac) i okolice Metkovića (Glušci). R. aeshlimani je bila prisutna u krpelja iz Dubrovnika i Benkovca. U pretraženim krpeljima dokazali smo različite uzročnike bolesti, no bez zoonotskog potencijala poput anaplazme A. ovis i parazita Babesia ovis te endosimbionta
Midichloria mitohondrii.

Diskusija


U sadašnjem istraživanju dokazani su krpelji Ixodes ricinus, Dermacentor marginatus, R. bursa, R. turanicus te Rhipicephalus sp. za koje smo smatrali da pripadaju vrsti Rhipicephalus sanguineus temeljem sličnih morfološkim karakteristika (Dantes Torres, 2013). Ovaj nalaz je od neobične važnosti jer svaka vrsta krpelja može prenijeti “svoje” uzročnike bolesti. Tako je krpelj R. sanguineus uspješan vektor brojnih uzročnika bolesti u pasa poput parazita Hepatozoon canis i Babesia vogeli, zatim anaplazme Anaplasma platys, erlihije Ehrlichia canis, ali i zoonotske rikecije Rickettsia conorii.
Danas se smatra da R. sanguineus predstavlja složenu vrstu/grupu krpelja stoga se u novijoj literaturi naziva R. sanguineus sensu lato i uključuje gotovo 17 srodnih, odnosno sličnih vrsta, a samim time posjeduje različit vektorski potencijal (Dantes Torres, 2008). U ovom preliminarnom istraživanju dokazali smo rikeciju R. massilae koja pripada skupini pjegavih groznica u krpelja Rhipicephalus sp. ali ne i R. conorii.
Ovi rezultati su u suglasju sa istraživanjima provedenim u Južnoj Americi (Moraes-Filho i sur., 2016) gdje su ustanovljene dvije genetske linije krpelja R. sanguineus sa različitim vektorskim kapacitetom za prijenos A. platys i E. canis vrsti R. sanguineus dok je genetski srodniji sa vrstom R. turanicus. Ovim istraživanjem također su dokazane vrste Hyalomma marginatum sa gotovo svih istraživanih područja dok je H. scupense dokazana u okolici Solina. Prisutnost patogena je istraživana lančanom reakcijom polimerazom i sekvencioniranjem umnoženih odsječaka a dobivene sekvence su nakon poravnavanja uspoređene sa dostupnim sekvencama u bazi gena NCBI. Potvrđena je prisunost R. aeshlimani u krpelja H. marginatum i po prvi puta R. massilae (iz skupine uzročnika pjegave groznice) u krpelja R. sanguineus i Rhipicephalus sp. dok rikecija R. conorii nije dokazna (Parola i sur., 2013).

Sam nalaz krpelja H. marginatum u gotovo svim istraživanim područjima je značajan jer je prijenosnik krimsko-kongoanske hemoragijske vrućice koja je endemijska na području Kosova. Njegova proširenost jasno ukazuje na potencijalnu opasnost u širenju bolesti i infekciji ljudi u Republici Hrvatskoj. Ovim istraživanjem dokazali smo rikeciju R. aeshlimani u H. marginatum sa područja Kune (Pelješac), Benkovca i Dubrovnika.
Rezultati ovog istraživanja predstavljaju osnovu za daljnja detaljnija istraživanja populacija krpelja u Republici Hrvatskoj i njihovog stvarnog vektorskog potencijala.
Također se otvaraju pitanja postojanja i drugih uzročnika poput erlihije E. canis koja je dokazana serološki no do sada nije potvrđen uzročnik molekularnim metodama.

Istraživanje je finacirano projektom Hrvatske zaklade za znanost 1957 GENOTICKTRECK i programom Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane.


Literatura [… prikaži]

Relja Beck, Sanja Bosnić, Renata Brezak, Tomislav Šarić, Antun Kostelić, Ivana Lohman Janković

TICKS FROM DALMATIA AND THEIR VECTOR POTENTIAL

Abstract


Ticks are, after mosquitoes, the most important vectors of diseases in humans and animals in the world, while in Europe they are recognized as the most significant vectors of numerous pathogens. A detailed and systematic research on species of ticks and pathogens that are transmitted has not been conducted nearly 50 years in the Republic of Croatia. In this study, we have analyzed the 192 ticks collected from the environment and the animals from Dalmatia with the aim of detecting the tick species and potentialy zoonotic pathogens they can transmitt. The presence of pathogens in ticks was investigated by polymerase chain reaction and direct sequencing. We have proven rickettsiae Rickettsia masillae and R. aeshlimanii from the group spotted fever agents. Morphological determination of 192 ticks revealed presence of: Hyalomma marginatum (32), Hyalomma scupense (4), Dermacentor marginatus (4), Ixodes ricinus (5), Rhipicephalus bursa (43), Rhipicephalus sanguineus (56) and Rhipicephalus turanicus (48). With sequencing of 16SrRNA all tick species were confirmed except R. sanguineus, therefore, the existence of R. sanguineus in Croatia is doubtfull. Our results are in line with the new data which define the tick as complex species Rhipecpahalus sanguineus sensu lato.
Key words: ticks, molecular, Dalmatia, Rickettsia masillae, R. aeshlimani


Vezani sadržaji

7. Hrvatski veterinarski kongres – program

Urednik

CEEPUS VetNEST Ljetna škola Zoonoze

Urednik

Spongiformna encefalopatija jelena – Chronic wasting disease (CWD)

Urednik

Gljivične bolesti u veterinarskoj kliničkoj praksi – izazovi dijagnostike i liječenja

Urednik

Primjer endemske i moguće emergentne virusne zoonoze u Hrvatskoj – hepatitis E i krimsko-kongoanska hemoragijska groznica

Urednik

Prijedlozi parazitologa za dijagnostiku i liječenje endoparazita u pasa i mačaka

Urednik

Ova web stranica koristi kolačiće radi poboljšanja korisničkog doživljaja pri njezinom korištenju. Korištenjem ove stranice suglasni ste s tim. Prihvati Više