Kvantifikacija kloramfenikola u hrani za životinje

Originalni znanstveni rad

Nina Bilandžić, M. Mitak, Božica Solomun Kolanović, Ivana Varenina, Đurđica Božić i Manuela Zadravec

---

Dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, dr. sc. Mario Mitak dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, dipl. ing. preh. biotehnol., Ivana VARENINA, dipl. ing. biotehnol., Đurđica BOŽIĆ, dipl. ing. preh. biotehnol., dr. sc. Manuela ZADRAVEC, dr. med. vet., Odjel za veterinarsko javno zdravstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb

Uvod

---

Kloramfenikol se kao antibiotik širokog spektra djelovanja oralno (baza ili palmitat) i parenteralno (baza ili sukcinat) koristio u liječenju mastitisa, pijelonefritisa, prostatitisa, meningitisa, salmoneloze, infekcija oka, infekcija vanjskog uha te drugih infekcija prouzročenih anaerobnim bakterijama (Dowling, 2006.).

Brojne su studije o oralnoj i parenteralnoj primjeni u ljudi potvrdile da je najznačajniji toksični učinak kloramfenikola na funkciju koštane srži (WHO, 2004.). U životinja je pri primjeni velikih doza ili dugoročene terapije utvrđena reverzibilna depresija aktivnosti koštane srži u svim vrstama, a ostali efekti u životinja su diarea, povraćanje, anoreksija i depresija (WHO, 2004.). S obzirom da je utvrđeno da ima citotoksični, genotoksični i hematotoksični utjecaj na ljudsko zdravlje zabranjen je za uporabu u životinja namijenjenih za hranu u Europskoj uniji (EC, 1994.) te u mnogim drugim zemljama, uključujući: SAD, Kanadu, Australiju, Japan i Kinu. Unatoč zabrani, kloramfenikol se i dalje nezakonito koristi pri uzgoju životinja zbog svoje učinkovitost i niske cijene, što pokazuju nalazi ostataka lijeka u posljednjih nekoliko godina u prehrambenim proizvodima. Tako su preko sustava brzog uzbunjivanja za hranu i hranu za životinje RASFF (engl. Rapid Alert System for Food and Feed) prijavljene povišene koncentracije u mesu peradi i ostalih životinja, ribi i ribljim proizvodima, rakovima, medu i matičnoj mliječi, mlijeku i mliječnim proizvodima te hrani za životinje (RASSAF, 2002.–2008.).
Stoga je potreban učinkovit nadzor i praćenje kloramfenikola u proizvodima životinjskog podrijetla, ali i u hrani za životinje.

Veliki broj nesukladnih rezultata kloramfenikola (više od 50%) zabilježen je u proizvodima uvezenih iz Azije, odnosno Kine, Vijetnama i Indije (RASSAF, 2002.–2008.). Tome mogu biti različiti uzroci kao što su ilegalno korištenje lijeka u stočarskoj proizvodnji, ingestija kloramfenikola koji potječe iz okoline ili kontaminacija sudjelovanjem radnika u proizvodnji, a koji je koristio kloramfenikol (Berendsen i sur., 2010.). Jedno od objašnjenja je i kontaminacija usljed prirodne pojave kloramfenikola u tlu jer ga biosintetiziraju mikroorganizmi iz tla Streptomyces venezuelae i nekoliko drugih Actynomycetea (EMEA, 1994.). Pretpostavljeno je da trava i bilje mogu apsorbirati i akumulirati kloramfenikol te ako se koriste za ispašu ili se dodaju hrani za životinje ili kao krmno bilje mogu posljedično kontaminirati proizvode životinjskog podrijetla (Berendsen i sur., 2010.).

Kontrola kloramfenikol u Europskoj se Uniji provodi primjenom kriterija granice najmanje zahtjevane učinkovitosti izvedbe metode (MRPL, engl. minimum required performance limit) od 0,3 μg/kg koja predstavlja minimalnu koncentraciju kloramfenikola u uzorku koju metoda mora detektirati (EC, 2003.). To je ujedno i referentna točka postupanja koja se koristi u ocjeni ispravnosti svih vrsta hrane. Za kvantifikaciju koncentracija kloramfenikola danas se koriste orijentacijski imunoenzimski testovi (ELISA) te plinska kromatografija s ECD detekcijom, GC-ECD (ECD, engl. Electro Capture Detector) (Cerkvenik-Flajs, 2006.), odnosno za potvrdne analize metode plinske i tekućinske kromatografije – tandemske spektrometrije masa (GC-MS/MS, LC-MS/MS) (Stolker i Brinkman, 2005., Peng i sur., 2006., Rønning i sur., 2006., Berendsen i sur., 2010., Douny i sur., 2013.).

Ova je studija nastala na temelju literaturnih podataka koji sugeriraju da se kloramfenikol može prirodno nalaziti u biljkama i travi koje se koriste za hranidbu, odnosno ispašu životinja koje se koriste u proizvodnji namirnica životinjskog podrijetla. Stoga je glavni cilj ovog istraživanja bio provesti određivanje kloramfenikola u različitim vrstama hrane za životinje. Za kvantifikaciju je primijenjena orijentacijska ELISA metoda koja je validirana prema Odluci Komisije 2002/657/EC (EC, 2002.).

▲

Materijali i metode

---

Prikupljanje uzoraka

Tijekom 2013. i 2014. godine ukupno je prikupljeno ukupno 156 uzoraka hrane za životinje farmi diljem Hrvatske.
S obzirom na vrstu uzoraka hrane za životinje broj uzoraka je bio namijenjen za: 56 perad (konzumne nesilice, pilići, purići), 50 goveda (muzne krave, junad), 50 svinje (tovljenici, odojci).
Nakon prikupljanja, uzorci su usitnjeni, pohranjeni u polietilenske vrećice, označeni te čuvani na tamnom i suhom mjestu do analize.

Reagensi i standardi

Koncentracije kloramfenikola određivane su primjenom ELISA kita proizvođača EuroProxima B.V. (Arnhem, Nizozemska). Kit se sastoji od: mikrotitarska ploča (96 jažica), standardna otopina kloramfenikola 100 ppb (spremno za uporabu), otopine standarda kloramfenikola (2, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 i 0 ng/mL), pufer za razrijeđivanje (4x koncentriran), pufer za ispiranje (20x koncentriran), pufer za rekonstituciju konjugata i protutijela/zero standard (spremno za uporabu), otopin supstrat/kromogen (spremno za uporabu), stop otopine (spremno za uporabu), konjugat (liofilizirani), protutijela (liofilizirano).
Standard kloramfenikola nabavljen je od proizvođača Sigma (St. Louis, SAD).
Metanol, kloroform i amonij acetat nabavljeni su od J. T. Baker (Deventer, Nizozemska).
Etil acetat je nabavljen od Carlo Erba (Milano, Italija). Izooktan je nabavljen od Kemike (Zagreb, Hrvatska). Dušik 5,0 i 5,5 za uparavnje uzoraka nabavljen je od SOL spa (Monza, Italija). Ultra čista voda je pripremljena koristeći sustav Direct Q 5UV (Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka).
Bazne otopine standarda pripremljene su otapanjem analita u metanolu. Radne otopine upotrebljavane za obogaćivanje slijepih uzoraka dobivene su daljnjim razrjeđivanjem, koristeći isto otapalo do koncentracije od 1 μg/mL. Bazne i radne otopine standarda su pohranjene na +2 do +8 °C.

Instrumenti

U pripremi uzorka korišteni su sljedeći instrumenti: homogenizator Ultra-Turrax^® model T25IKA^® , Vortex model VWR, VX-2500 (IKA^® -WERKE GMBH & CO.KG, Njemačka), centrifuga ROTANTA 460 R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Njemačka), uparivač dušikom N-EVAP model 111 (Orgamonation Associates Inc., Berlin, Njemačka).
Vrijednosti apsorbance za ELISA metodu mjerene su na mikročitaču Tecan model Sunrise (Tecan, Austria GmbH, Salzburg, Austrija).

Priprema uzorka

Homogenizira se 5 g usitnjenog uzorka s 20 mL destilirane vode te se odpipetira 5 mL ove mješavine u staklenu epruvetu. Doda se 10 mL etil acetata i miješa 30 minuta te centrifugira 10 minuta pri 2000 x g. Pipetira se 5 mL gornjeg sloja etil acetata u staklenu epruvetu i upari u blagoj struji dušika pri 50 °C. Masni se ostatak otopi u 0,5 mL mješavine izooktan/kloroforma (2:3, v/v) i doda 0,5 mL pufera za razrijeđivanje uzoraka te miješa 1 minutu. Centrifugira se 10 minuta pri 2000 x g. Za analizu se koristi 50 μL gornjeg sloja.

Postupak elisa testa

Test je proveden prema uputama proizvođača Euro-Proxima. Apsorbancija je mjerena pri 450 nm, uporabom spektrofotometra za ELISA mikrotitarske pločice.

Validacija metode

Postupak validacije metode za određivanje kloramfenikola u uzorcima hrane za životinje proveden je sukladno zahtjevima Odluke Komisije 2002/657/EC (EC, 2002.). Određeni su validacijski pokazatelji: sposobnost dokazivanja CCβ, granica detekcije LOD, granica kvantifikacije LOQ, iskorištenje i ponovljivost. Granica detekcije LOD i granica kvantifikacije LOQ izračunati su nakon analiziranja 20 negativnih uzoraka, odnosno tako da se srednjoj vrijednosti ponavljanih uzoraka pribroji 3 (LOD), odnosno 10 (LOQ) standardnih devijacija uzoraka. Granična koncentracija CCα određena je kao zbroj srednje vrijednosti koncentracije slijepih uzoraka i standardne devijacije odgovora slijepih uzoraka pomnožene s 2. Sposobnost dokazivanja CCβ (β=5%) je dobivena kao zbroj granične koncentracije i odgovarajuće standardne devijacije pomnožene s 1,64. Iskorištenje je određeno obogaćivanjem slijepih uzoraka mlijeka na tri koncentracijska nivoa: 0,15, 0,3 i 0,45 mg/kg. Također određena je i ponovljivost rezultata izračunom koeficijenta varijacije rezultata CV%.

Statistička analiza

Statistička analiza je provedena računalnim programom Statistica 6,1 (StatSoft^® Inc., Tulsa, SAD). Koncentracije kloramfenikola su izražene kao minimalna i maksimalna koncentracija, srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD).

▲

Rezultati i rasprava

---

Prijašnja istraživanja potaknula su tezu da postoji realna mogućnost da proizvodi životinjskog podrijetla mogus adržavati ostatke kloramfenikola koji nisu podrijetlom od (ilegalne) uporabe lijeka, nego su posljedica prirodnih koncentracija iz biljaka (Berendsen i sur., 2010., 2011., Stolker i sur., 2012.).
RASFF sustavom je u 2002., 2003., 2004. i 2008. zabilježeno 20, 3, 4 i 6 hrane za životinje s povišenim koncentracijama kloramfenikola (RASFF, 2002.-2008.). Pri tome je najviša koncentracija od 33,5 ug/kg utrđena u ribljoj smjesi podrijetlom s Islanda (RASFF. 2004.).

U ovome su radu koncentracije kloramfenikola u hrani za životinje određivane ELISA metodom čiji su parametri validacije prikazani u Tabeli 1.

U postupku validacije je utvrđeno da je metoda sposobna detektirati koncentracije od 0,032 μg/kg kloramfenikola što je znatno manje od zahtjevane učinkovitosti izvedbe metode (MRPL) od 0,3 μg/kg. Kloramfenikol se detektira pri koncentracijama od 0,3 μg/kg uz vrlo dobru ponovljivost. Najniža koncentracija koju je metoda sposobna dokazati uz vjerojatnost pokazivanja lažno negativnog rezultata od 5% (CCβ) je 0,15 μg/kg. Određeno je ukupno iskorištenje za ELISA metodu od 80,8% te je unutar preporučenog raspona od 50% do 120%. Testiranje ponovljivosti pokazalo je da ponavljanje analiza uzoraka daje neznačajno rasipanje rezultata, odnosno koeficijent varijacije CV od 17,8% (manje od 25%).

U ovome istraživanju je tijekom 2013. i 2014. godine prikupljeno i analizirano ukupno 156 uzoraka hrane za životinje.
U samo 12 uzoraka koncentracije kloramfenikola bile su iznad LOD vrijednosti metode od 0,032 μg/kg doksu u 1 44 uzorka koncentracije bile ispod LOD (Tabela 2). Za 12 uzoraka koji su se mogli kvantificirati vrijednosti su se kretale u rasponu 0,035 – 0,1252 μg/kg, a srednja vrijednost je 0,0698 μg/kg.

Prvotno istraživanje provedeno u Nizozemskoj uključivalo je uzorke biljnog materijala prikupljenog u Mongoliji tijekom 2007. godine, zatim uzorke iz lokalnih trgovina u Nizozemskoj te uzorke biljke Artemisia frigida iz države Utah, SAD (Berendsen i sur., 2010.). U biljnim uzorcima iz Mongolije kloramfenikol je određen do koncentracije od 450 μg/kg.
U jednoj biljnoj smjesi iz lokalne trgovine u Nizozemskoj te uzorku A. frigida kloramfenikol je kvantificiran na niskoj razini. Rezultati ispitivanja pokazali su da biljke različitih porodica mogu sadržavati kloramfenikol, a određen je i u biljkama iz porodice Artemisia ili Thalictrum, ali i u travi. Zatim je u 2009. godini s Mongolijskih pašnjaka prikupljeno ukupno 192 uzoraka lišća, korijena, stabljika A. sieversiana i A. frigida i tla te je analizom reprezentativnih 87 uzoraka u 13 uzoraka utvrđena mjerljiva koncentracija kloramfenikola. U samo pet uzoraka od 13 koncentracije su bile između 1 i 5 μg/kg, dok su u svim drugima bile manje od 1 μg/kg. Nisu utvrđene specifične veze između koncentracija u tlu i u biljkama, odnosno koncentracije pronađene na određenom mjestu. Čini se da su uzorci koji sadrže kloramfenikol nasumično raspoređeni. Pretpostavlja se da razlike u koncentracijama biljnih uzoraka iz Mongolije između 2007. (suha godina) i 2009. (vrlo vlažna godina), mogu biti i posljedica razlike u klimatskim uvjetima koji imaju jak utjecaj na biosintezu kloramfenikola u mikroorganizmima u tlu i njegove apsorpcije u biljke.

Nakon ovog istraživanja u Nizozemskoj je usljedilo prvo praćenje kloramfenikola u slami pri čemu je u 57% (od n=21) uzoraka utvrđena koncentracija uglavnom ispod 1 μg/kg, a maksimalna koncentracija bila je 11 μg/kg (Stolker i sur., 2012.). Opširnija studija (n=104) pokazala je 37 pozitivnih uzoraka (36%), od kojih je sedam bilo iznad 0,3 μg/kg dok je jedan rezultat bio iznad 1 μg/kg, odnosno iznosio je 6,8 μg/kg (Berendsen i sur., 2011.).

Nedavna daljnja istraživanja istih autora potvrdila su da Streptomyces venezuelae može proizvoditi znatnu količinu kloramfenikola u nesterilnom tlu (Berendsen i sur., 2013.). Istraživan je i prijenos kloramfenikola iz tla uporabom pšenice i kukuruza na tri različita tla koja su zalijevana vodom koja sadrži kloramfenikol različitih koncentracija.
Utvrđeno je da je kloramfenikol preuzet u biljke te da je razina u kulturama u korealaciji s primijenjenim koncentracijama.
Prema tome je zaključeno da se ostatci kloramfenikola mogu pojaviti u usjevima kao rezultat proizvodnje kloramfenikola bakterijama u tlu što prouzroči dospijevanje u usjeve.

Zaključno, u ovome istraživanju nisu utvrđene značajne koncentracije kloramfenikola koje bi mogle upućivati da su u sastojcima hrane za životinje prisutne količine kloramfenikola.
Međutim, istraživanja u Nizozemskoj skreću pažnju na to da se kloramfenikol može pojaviti kao posljedica proizvodnje bakterija u tlu, što ga ujedno svrstava u grupu ksenobiotika, a to otvara vrata brojnim diskusijama i promjenama propisa koji reguliraju međunarodnu trgovinu i sigurnost potrošača.

▲

Sažetak

---

Kloramfenikol je antibiotik širokog spektra te ima povijesni tijek u korištenju u veterinarskoj praksi u većini životinja za proizvodnju hrane, u liječenju različitih infekcija prouzročenih aerobnim i anaerobnim mikroorganizmima. Postoji zabrinutost zbog potencijalne genotoksičnosti kloramfenikola i njegovih metabolita na embrije i fetuse te kancerogenog utjecaja i uzrokovanja aplastične anemije u ljudi. Zbog potencijalnog zdravstvenog rizika koji predstavlja i u svojim tragovima u hrani godine 1994. zabranjena je primjena kloramfenikola u životinja za proizvodnju hrane u Europskoj uniji (EU).
Uspostavljena je obvezna kontrola ostataka kloramfenikola u hrani i postavljen je kriterij granice najmanje zahtjevane učinkovitosti izvedbe metode (MRPL) od 0,3 μg/kg za metode koje se koriste za kvantifikaciju.
Ukupno 156 uzoraka hrane (56 za perad, 50 za goveda, 50 za svinje) je prikupljeno u 2013. i 2014. godini i analizirano na ostatake kloramfenikola. ELISA metoda korištena za kvantifikaciju kloramfenikola je validirana u skladu s kriterijima propisanim Odlukom Komisije 2002/657/EC te su utvrđeni sljedeći parametri: LOD (granica određivanja) 0,032 μg/kg, LOQ (granica kvantifikacije) 0,084 μg/kg, CCβ (sposobnost dokazivanja) 0,15 μg/kg, iskorištenje 80,8%, preciznost izražena kao CV od 17,8%. Za 144 uzoraka hrane određene su koncentracije ispod LOD vrijednosti. Za 12 kvantificiranih uzoraka koncentracije su u rasponu od 0,035 do 0,1252 μg/kg, a srednja vrijednost je 0,0698 μg/kg. Stoga su utvrđeni rezultati koncentracija kloramfenikola ispod MRPL i može se zaključiti da ostatci kloramfenikola nisu utvrđeni u analiziranim uzorcima hrane.

Literatura [… prikaži]

▲

Quantification of Chloramphenicol Residues in Feed

---

Nina BILANDŽIĆ, BSc, PhD, Scientific Advisor, Mario MITAK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, BSc, Ivana VARENINA, BSc, Đurđica BOŽIĆ, BSc, Manuela ZADRAVEC, DVM, PhD, Department for Veterinary Public Health, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

---

Chloramphenicol is a broad-spectrum antibiotic with historical veterinary uses in most food-producing animals for the treatment of a variety of infections caused by aerobic and anaerobic microorganisms. There is concern about the potential genotoxicity of chloramphenicol and its metabolites and of its embryo-and foetotoxicity, its carcinogenic potential in humans and as a cause of aplastic anaemia. Due to the potential health risk posed by its traces in food, the use of chloramphenicol was banned in food-producing animals by the European Union (EU) in 1994. The EU established mandatory controls of chloramphenicol residues in food and also has set a minimum required performance limit (MRPL) of 0.3 μg/kg for quantification methods. A total of 156 feed samples (56 for poultry, 50 for bovine, 50 for pigs) were collected in 2013 and 2014 and analyzed for chloramphenicol residues. The ELISA method used for chloramphenicol quantification was validated according to the criteria laid down by Commission Decision 2002/657/EC and the following parameters were set: LOD (limit of detection) 0.032 μg/kg, LOQ (limit of quantification) 0.084 μg/kg, CCß (detection capability) 0.15 μg/kg, recovery 80.8%, precision expressed as CV of 17.8%.
For 144 feed samples, levels were below the LOD value. For 12 quantified feed samples, concentrations ranged from 0.035 to 0.1252 μg/kg and the mean value was 0.0698 μg/kg.
Therefore, the presented results were below the MRPL for chloramphenicol and it may be concluded that chloramphenicol residues were not found in analyzed feed samples.