MHC class II genes– diversity and application in wildlife research

Bujanić, M., D. Konjević

---

Miljenko BUJANIĆ, dr. med. vet., doktorand, dr. sc. Dean KONJEVIĆ, dr. med. vet., Dipl. ECZM, docent, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb

▲

Sažetak

---

Geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (MHC) ubrajaju se među najraznolikije gene kralježnjaka, a dijele se na gene klase I i II. Glede važnosti MHC gena za otpornost/prijemljivost na bolest razvijene su dvije pretpostavke. Prema jednoj odnos prema bolesti ovisan je o heterozigotnosti, pri čemu bi takozvane homozigotne jedinke trebale biti manje otporne. Iako ova pretpostavka ima uporišta u nekim istraživanjima, u drugima to nije potvrđeno. Druga pretpostavka govori da su u odnosu prema uzročniku bolesti važniji točno određeni aleli, a ne raznolikost. I ova pretpostavka ima argumente i za i protiv u dosadašnjim istraživanjima. U ovome radu prikazujemo neke od istraživanja MHC gena u divljih životinja te raspravljamo o njihovoj primjenjivosti u proučavanju odnosa patogena i organizma.

---

Ključne riječi: geni glavnog sustava tkivne podudarnosti, MHC, divlje životinje, bolest.

Abstract

---

Major histocompatibility complex genes (MHC) are among the most variable genes in vertebrates, and can be divided into class I and II genes. Regarding their significance for resistance/susceptibility to disease, two major hypotheses have been developed. One states that their relationships with pathogens are dependent on heterozygosity, suggesting that individuals expressing MHC homozygosity should be less resistant.
Even though this hypothesis is supported by some studies, in others this was not confirmed. The other hypothesis claims that the presence of specific alleles, rather than heterozygosity, plays a major role in disease resistance/susceptibility. Research of this hypothesis also shows arguments for and against. In this paper we present some studies on MHC genes in wildlife and discuss their applicability in studying the relationships between pathogens and organisms.

---

Key words: major histocompatibility complex genes, MHC, wildlife, disease.

▲

Uvod

---

Da bi obrambeni sustav organizma mogao reagirati na infekciju ili invaziju različitim patogenima, morao je razviti sustav njihova prepoznavanja kao preduvjet za pokretanje obrambenog odgovora. Taj sustav razlikovanja vlastitog od stranog tkiva temelji se na složenim organskim molekulama (bjelančevine, glikoproteini, lipoproteini, polisaharidi, lipopolisaharidi, nukleinske kiseline) koje svaka stanica nosi na svojoj površini. Te molekule u stranom organizmu mogu uzrokovati imunosnu reakciju, odnosno drugim riječima organizam ih prepoznaje kao antigen. Tkivni antigeni su glikoproteini, a nalaze se na svim stanicama određenog organizma. Ako je riječ o tkivnim antigenima vlastitog organizma govorimo o autolognim, a ako su od drugog organizma (mikroorganizma), o alogenim ili ksenogenim. Tkivne antigene kodira sustav gena tkivne podudarnosti (MHC).
Pojam MHC gena prvi put spominje Peter A. Gorer 1936. godine (Klein, 1986.).

U skladu s navedenim, tkivni antigeni su transmembranski glikoproteini uklopljeni u staničnu membranu. Dijele se u dvije osnovne skupine: antigeni tkivne podudarnosti skupine I (molekule MHC skupine I) te antigeni tkivne podudarnosti skupine II (molekule MHC skupine II) (Day i Schultz, 2013.).
Neki autori, u ovisnosti o naravi istraživanja antigene tkivne podudarnosti preferiraju zvati receptorima ili glikoproteinima, dok pojam antigeni ostavljaju za slučaj stranih molekula, patogena ili pak prilikom transplantacije organa.

Glikoproteini MHC skupine I nalaze se na svim tjelesnim stanicama koje imaju jezgru. Građeni su od dvaju lanaca, duljeg α-lanca i kraćeg β 2 – mikroglobulina. Pri tome se α-lanac sastoji od tri domene (α 1 , α 2 i α 3 ) (Day i Schultz, 2013.). Ove glikoproteine kodiraju MHC geni skupine I. Glikoproteini MHC skupine I prikazuju antigene (virusne i tumorske antigene) citotoksičnim T-limfocitima. Da bi ih prikazali, proteinski se antigeni razgrađuju pomoću enzima do peptida te u endoplazmatskom omrežju nastaje kompleks peptid-receptor MHC skupine I.
Njega nakon izlaganja na površini stanice prepoznaju citotoksični T-limfociti (slika 1). Domene α-lanca (α1 i α2) jesu varijabilni dijelovi molekule, a stvaraju žlijeb sa zatvorenim krajevima čija je funkcija vezivanje antigenih peptida veličine 8 do 10 aminokiselina. Domena α3 je nevarijabilna i veže se za molekulu CD8+ na citotoksičnim T-limfocitima (Klein i sur., 1997.; Dengjel i sur., 2005.).

Glikoproteini MHC skupine II nalaze se na površini nekih imunosnih stanica (makrofagi, dendritične stanice, B-limfociti), a sastoje se od dvaju transmembranskih lanaca, α-lanca (α 1 i α 2 domena) i β-lanca (β 1 i β 2 domena) (Day i Schultz, 2013.). Njihova je funkcija prikazivanje izvanstaničnih antigena pomoćničkim T-limfocitima. Makrofagi, dendritične stanice i B-limfociti ih fagocitiraju, prerađuju i prikazuju na svojoj površini u okviru MHC receptora skupine II (slika 1).
Domene α1 i β1 su varijabilne, formiraju žlijeb otvorenih krajeva čija je funkcija vezivanje antigenskih peptida veličine 10 do 30 aminokiselina. Konstantna domena β2 vezana je na pomoćničkim T-limfocitima za molekulu CD4+ (Klein i sur., 1997.; Dengjel i sur., 2005.).

Kao što je već spomenuto, glikoproteini MHC skupine I i II određeni su kompleksom gena tkivne podudarnosti. Osnovna svojstva sustava MHC gena u najvećem su broju vrsta poligenost i polimorfnost, odnosno sastoje se od velikog broja gena, a geni su u populaciji prisutni u obliku različitih alela. Dijelovi genoma koji sudjeluju u prikazivanju antigena (MHC geni) najvarijabilniji su lokusi koji daju upute za sintezu proteina u kralježnjaka.

Dobro je poznat i proučen glavni sustav tkivne podudarnosti u miša, koji se dijeli u tri skupine. Geni skupine I broje oko 40 gena, svrstavaju se u regije K, D, L, Qa i Tla te su izrazito heterozigotni. Kodiraju glikoproteine koji se sastoje od dvaju polipeptidnih lanaca, lakog i teškog. Polimorfnost glikoproteina skupine I proizlazi iz varijabilnosti α-1 i α-2 nukleotidnog slijeda teškog lanca. MHC gene skupine II čine geni A-β, A-α, E-β i E-α koji tvore glikoproteine I-A (A-β i A-α) i I-E (E-β i E-α). Oba lanca glikoproteina, α (Mr = 34 000) i β (Mr = 29 000), nalaze se dijelom u stanici, a njihovi izvanstanični dijelovi α-2 i β-2 jako sliče segmentu teškog lanca MHC skupine I (α-3).

U čovjeka se sustav MHC gena nalazi na šestom kromosomu, a s obzirom na to da se sustav glikoproteina tkivne podudarnosti nalazi na leukocitima, na zivamo ga HLA sustavom (engl. human leukocyte antigens). Molekula HLA skupine I sastoji se od 45 kD α-lanca kodiranog od strane MHC gena klase I, te je taj α-lanac povezan nekovalentnim vezama s 12 kD β2 mikroglobulinskim lancem kodiranim na 15. kromosomu. MHC antigeni skupine I povezani su s membranom jednim transmembranskim segmentom α-lanca (slika 2).

Molekula HLA skupine II građena je od α-lanca (32 kD) i β-lanca (28 kD), povezanih nekovalentnom vezom, od kojih su oba kodirana MHC genom klase II i uklopljena su u membranu (Gregersen, 2008.). Ljudski MHC sustav uključuje oko 4 milijuna parova baza na kratkom dijelu 6. kromosoma. Na slici 3 vidljivo je da su geni HLA skupine I i HLA skupine II smješteni na različitim mjestima na kromosomu. Pri tome se α-lanac HLA gena klase I nalazi na telomernoj strani MHC molekule, a sastoji se od klasičnih dijelova HLA-A, HLA-B i HLA-C koji se još nazivaju klasa Ia gena. Postoje još dijelovi HLAG, HLA-E, HLA-F koji se ubrajaju u klasu Ib gena, a zbog njihova ograničavajućeg polimorfizma smatralo se da nisu funkcionalni. No, pokazalo se da imaju značajnu imunosnu funkciju, posebice HLA-G i HLA-E koji mogu djelovati kao ligandi inhibitornih receptora prirodnih stanica ubojica. HLA geni klase II smješteni su centromerno od klase I i njihov je raspored mnogo kompliciraniji. Podijeljeni su u tri glavne podregije, DR, DQ i DP, od kojih svaka sadržava varijabilni broj α i β-lanca gena. Zbog te varijabilnosti došlo je do izrazite zamršenosti pri nomenklaturi tih gena, posebice sa DR podregijom čiji α-lanac nema značajnih varijacija alela, dok su geni β-lanca izrazito polimorfni i razlikuju se po broju među različitim jedinkama populacije (slika 3). DQ podregija sadržava samo jedan par gena α i β-lanca, označenih DQA1 i DQB1.

Podregije lanaca građene su od introna i eksona.
Većina istraživanja MHC gena klase II kod sisavaca usmjerena je na drugi ekson DRB podregije, zbog pripadnosti genu koji kodira dio molekule bitan za vezivanje antigena. Taj je lokus pokazatelj genske varijacije, odnosno nositelj funkcionalne raznolikosti receptora, te je na tom području dokazana najveća različitost među alelima i haplotipovima (Sommer, 2005.; Murray i sur., 1999.).

▲

MHC geni klase II kod životinja

---

Kod konja su MHC geni smješteni na dvadesetom kromosomu. Za razliku od ostalih sisavaca, kod konja je DRA lokus polimorfan, te je do sada poznato barem 11 alela (Tizard, 2013.). Taj opsežan polimorfizam DRA lokusa kod magaraca na području Balkana istraživali su Arbanasić i suradnici (2013.a). Identificirali su 5 već poznatih i 2 nova alela.

MHC geni goveda specifični su po inverziji jednog velikog segmenta kromosoma, zbog čega je dio MHC gena klase II smješten skroz do centromere 23. kromosoma, odnosno MHC sustav razdvojen je u dvije podregije, MHC geni klase IIa i IIb, međusobno razdvojene „prazninom“ od 17 centimorgana (cM) (slika 4). MHC geni klase II kodiraju dvije molekule proteina, DQ i DR, od kojih je DQ lokus često dupliciran.
DQA, DQB i DRB su polimorfni lokusi, dok DRA nije polimorfan (Tizard, 2013.).

Ovce imaju smješten MHC sustav na 20. kromosomu. Regija MHC gena klase II sastoji se od 12 lokusa, DRA, DRB, DQA1, DQA2, DQB1, DQB2, DNA, DOB,DYA, D YB, DMA i DMB, od kojih se lokus DRB javlja u 4 alela, a DQA2 u 2 alela (Tizard, 2013.).

U svinja se sustav MHC gena nalazi na 7. kromosomu i podijeljen je centromerom, a specifičnost njihova MHC sustava jest da je najkraći od svih sisavaca, sastoji se od svega oko 2 milijuna parova baza.
Klasa II MHC gena ima lokuse SLA-DR, -DQ, -DM i – DO, a nema lokusa DP (Tizard, 2013.).

Lokusi psećeg MHC sustava su na 12. kromosomu te je njihova polimorfnost jako izražena kod MHC gena klase II. Kod lokusa DRB1 identificirana su 62 alela, DQA1 lokus ima 21 alel, a DQB1 lokus 48 alela.
Pojedini haplotipovi pojavljuju se kao karakteristike specifičnih pasmina, a ujedno postoje velike razlike među različitim pasminama. Ta visoka varijabilnost između različitih pasmina te ujedno niska unutarpasminska varijabilnost pomažu kod proučavanja razlika osjetljivosti na pojavu infekcije i autoimunosnih bolesti pojedinih pasmina pasa (Tizard, 2013.).

Kod mačaka je MHC sustav smješten na kromosomu B2 i po veličini je između mišjeg i ljudskog MHC sustava. MHC sustav klase II nema funkcionalan DP lokus, dok je DQ lokus izbrisan, što je karakteristika jedino kod mačaka. Da bi se to kompenziralo, pojavljuje se velika polimorfnost DR lokusa s dva DRB gena i 24 alela, te tri DRA gena (Tizard, 2013.).

▲

Istraživanja raznolikosti MHC gena u divljih životinja

---

Istraživanja MHC gena u divljih životinja usmjerena su u dva pravca, istraživanje stupnja varijabilnosti te povezivanje varijabilnosti s određenim uzročnicima bolesti. Pri tome, glede odnosa prema bolesti, postoje dvije pretpostavke, jedna koja predmnijeva da su heterozigotne jedinke rezistentnije te druga koja pak govori da je otpornost/prijemljivost uvjetovana točno specifičnim alelima (Doherty i Zinkernagel, 1975.; Takahata i Nei, 1990.). Unatoč činjenici da su obje pretpostavke postavljene razmjerno davno, rasprave o tome koja je od njih točna traju do danas (Sommer, 2005.; Piertney i Oliver, 2006.).

Hedrick i suradnici (2001.) proveli su istraživanje na divljim konjima (Equus przewalskii). Proučavali su MHC gene 14 jedinki s različitih lokacija te su utvrdili da postoji šest različitih sekvencija DRB lokusa MHC gena klase II od kojih se u najviše jedinki pojavljuju samo dvije. Kod sjevernoameričkih bizona (Bison bison) utvrđeno je devet različitih alela na DRB3 lokusu MHC gena klase II (Mikko i sur., 1997.). Uspoređivali su i polimorfizam lokusa DRB3 poredbeno kod bizona i goveda te su utvrdili postojanje istih sekvencija kod obiju vrsta. Interalelne rekombinacije kod bizona i goveda znatno su utjecale na stvaranje raznolikosti alela na istraživanom lokusu.

Hedrick i suradnici (2000.) istraživanjem na arapskim oriksima (Oryx leucoryx) našli su samo tri izrazito divergentna DRB alela, što je najvjerojatnije posljedica genetskog bottle-necka s obzirom na to da je populacija u divljini izumrla te jedine primjerke ove vrste imamo podrijetlom od malog broja u zatočeništvu. Slične rezultate polučilo je i istraživanje koje su Radwan i suradnici (2007.) proveli na europskim bizonima (Bison bonasus). Istraživanje je naime pokazalo da 172 pretražene jedinke na lokusu DRB3 MHC gena klase II imaju raznolikost u svega 4 alela. Osim toga, isti su autori proučavali i povezanost pojedinih alela s osjetljivošću na pojavu postitisa, ali nisu dobili potvrdne rezultate. Slično kao i kod arapskih oriksa i populacija europskog bizona je nakon istrebljenja u slobodnoj prirodi vraćena u divljinu kroz posebne programe od svega nekoliko jedinki iz zatočeništva.
Sličnu homozigotnost nalazimo i u geparda (Aconyx jubatus), azijskog lava (Panthera leo persica) i losa (Alces alces). Ipak, treba naglasiti kako niska varijabilnost MHC gena nije nužno povezana s niskom genetskom varijabilnošću. Takav je slučaj u primjerice europskog dabra (Castor fiber), Rudolfijevog kita (Balaenoptera borealis), kita perajara (Balaenoptera physalus) i južnog morskog slona (Mirounga leonina). Slično su Aguilar i suradnici (2004.) utvrdili na otočnoj lisici (Urocyon littoralis dickeyi) s otoka San Nicolas. Doduše, ona je specifičan primjer izolirane populacije koja živi u prirodnim uvjetima. Kao takva je vrlo dobar primjer monomorfne populacije i gotovo da i nema razlike u hipervarijabilnim genskim markerima. Istraživanjem nije utvrđena raznolikost na mikrosatelitima, ali je uočena vrlo visoka razina raznolikosti na lokusima MHC gena.

Kod Malagaškog divovskog skočimiša (Hypogeomys antimena) Sommer (2003.) je proučavala kako odvajanje, uzrokovano fragmentacijom staništa, i posljedično smanjenje populacije djeluje na nekodirajuću mitohondrijsku DNA molekulu te na kodirajuće lokuse MHC gena (DQA i DRB). Ni na mitohondrijskim ni na MHC markerima nije otkriven značajniji učinak smanjenja protoka gena zbog izolacije staništa. Slična očuvanost varijabilnosti unatoč smanjenju brojnosti populacije i fragmentaciji i gubitku staništa utvrđena je i na primjeru vukova (Canis lupus) u Hrvatskoj (Arbanasić i sur., 2013.b).

Märten i suradnici (2002.) proučavali su djeluju li MHC geni klase II na imunogeni potencijal tumorskih stanica te su dokazali povećanje aktivnosti dendritičnih stanica (lučenje interleukina-12 bilo je značajno pojačano) stimuliranih tumorskim stanicama koje su bile transformirane pomoću MHC gena klase II, dok normalne tumorske stanice u pravilu nemaju MHC gene klase II. Osim toga, utvrđeno je da pojava određenih alela MHC gena dovodi do pojačane otpornosti ovaca na invazije želučano-crijevnim oblićima (Schwaiger i sur., 1995.).

S druge strane, na primjeru jelena običnog u
Španjolskoj (Cervus elaphus hispanicus) istraživano je kako MHC geni, veličina slezene i tjelesno stanje utječu na pojavu bolesti. Utvrdilo se da postoji velika funkcionalna važnost MHC gena klase II (lokus DRB-2) kod obrane protiv parazitskih bolesti te povezanost lokusa DRB-2 s veličinom slezene i tjelesnim stanjem same životinje (Fernandez-de-Mera i sur., 2009.).

Radwan i suradnici (2010.) istraživali su uzrok velikog postotka invazije europskih bizona hematofagnim oblićima Ashworthius sidemi. Oni su utvrdili 4 visoko divergentna alela na DRB lokusu MHC gena klase II, ali ta heterozigotnost DRB lokusa nije bila povezana s postotkom invazije parazitima. Nasuprot tomu, povećanje gustoće populacije zbog okupljanja tijekom zimskog hranjenja bilo je izravno povezano s povećanjem invazije ovim oblićima, što je i razumljivo zbog samog rizika prijenosa uzročnika. Axtner i Sommer (2011.) proučavali su povezanost pojave imunosupresije pod utjecajem parazita s MHC genima klase II. Istraživanjem su zaključili da invazija žutogrlog šumskog miša (Apodemus flavicollis) oblićima Heligmosomoides polygyrus ima sistemski imunosupresivni učinak. Ditchkoff i suradnici (2005.) proučavali su povezanost invazija ektoparazitima i endoparazitima u bjelorepih jelena (Odocoileus virginianus) i utvrdili povezanost između varijabilnosti i invazija.

Zhang i suradnici (2015.) utvrdili su statistički značajnu povezanost Aime-DRB1*10 i prijemljivost na parazite kod pandi (Ailuropoda melanoleuca), podupirući pri tome pretpostavku o određenim alelima odgovornim za otpornost/prijemljivost.

▲

Završne pripomene

---

Geni glavne tkivne podudarnosti (MHC) važan su čimbenik u obrani organizma. Oni ujedno predstavljaju najraznolikije gene u kralježnjaka. Ipak, uloga raznolikosti ovih gena u otpornosti/prijemljivosti na određene bolesti do danas nije u potpunosti razjašnjena. Naime, znanstvenici i dalje nalaze potvrde i za pretpostavku koja govori o odnosu heterozigotnosti prema bolesti, kao i za pretpostavku da su za otpornost/sklonost nekoj bolesti zaslužni točno specifični aleli. Uz takvo stanje stvari niti jedna od navedenih pretpostavki ne može se odbaciti, a sve više se čini da jedna drugu niti ne isključuju. U svakom slučaju, osim navedenoga raznolikost MHC gena zanimljiva nam je i kroz prizmu međuodnosa i promjena uzročnika bolesti i divljih životinja, neovisno o tome hoće li se utvrditi povezanost između MHC gena i otpornosti prema bolesti.

▲

Zahvala

---

Rad je u potpunosti potpomognut sredstvima projekta Hrvatske zaklade za znanost “Molekularna epidemiologija odabranih parazitskih bolesti divljih životinja”, šifra 3421.

Literatura [… prikaži]