Manuela Zadravec, Mario Mitak, Vesna Jaki Tkalec i Darko Majnarić
Dr. sc. Manuela ZADRAVEC, dr. med. vet., postdoktorand, dr. sc. Mario MITAK, znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb; dr. sc. Vesna JAKI TKALEC, dr. med. vet., postdoktorand, dr. sc. Darko MAJNARIĆ, znanstveni suradnik, Veterinarski zavod Križevci
Uvod
Kvalitetna krmna smjesa da bi udovoljila visokim potrebama uzgojnih životinja mora biti dobro nutritivno i energetski izbalansirana te mikrobiološki ispravna. Mikrobiologija hrane za životinje podrazumijeva mikroorganizme u hrani koji se dodaju zbog postizanja bolje iskoristivosti hrane i produktivnosti životinja, ili se dodaju da bi umanjili štetnost mikroorganizama koji bi mogli prouzročiti bolesti (probiotici) (Sokolović i sur., 2006.). Međutim, hrana za životinje može sadržavati i mikroorganizme koji mogu i u malom broju ozbiljno narušiti zdravlje životinja u (npr. patogene bakterije rodova Salmonellae, Chlostridiae, Listeriae) te mikroorganizme koji se normalno nalaze u hrani za životinje (saprofitski mikroorganizmi) koji mogu, ako su prisutni u većem broju, prouzročiti promjenu boje, okusa i mirisa hrane kao posljedicu mikrobiološke aktivnosti koja se očituje gubitkom suhe tvari kroz iskorištavanje ugljikohidrata kao izvora energije za mikroorganizme, razgradnju lipida i proteina te time umanjuju nutritivnu vrijednost hrane (Mašić i sur., 2002., Magan i Aldred, 2007.). Producirajući hlapljive metabolite mikroorganizmi mijenjaju miris i okus hrane što kao posljedicu ima smanjen unos hrane, probavne poremećaje te smanjenje proizvodnosti životinja i narušavanje životinjskog imuniteta i zdravlja (Marković i sur., 2005). Krmiva koja nisu kontaminirana sporama mikotoksinogenih plijesni, ali koja su bila procesu rasta, transporta ili skladištenja kontaminirana mikotoksinogenim plijesnima, mogu sadržavati mikotoksine, koji isto tako mogu narušiti zdravlje životinja (Osho i sur., 2007., Pleadin i sur., 2012.). Stvarna se mikrobiološka kvaliteta krmiva i krmnih smjesa ne može ustvrditi osjetilima mirisa, vida i okusa, već je za procjenu mikrobiološke kvalitete potrebno izvršiti mikrobiološku pretragu.
Uvidjevši da mikrobiološka kvaliteta ima znatan utjecaj na hranidbenu vrijednost krmiva i krmnih smjesa sedamdesetih godina 20. stoljeća počeo se sprovoditi monitoring krmnih smjesa na sadržaj mikroorganizama u krmivima i krmnim smjesama na području Njemačke, Austrije i Švicarske u organizaciji VDLUFA grupacije, da bi 1981. godine bila opisana ujednačena metoda za određivanje mikrobiološke klasifikacije krmiva i krmnih smjesa.
VDLUFA (Verbands Deutscher Landwirdschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten) je udruženje njemačkih agronomskih, analitičkih i istraživačkih isntituta koja se bave različitim vrstama istraživanja u području agronomije te razvojem, prilagođavanjem i validacijom analitičkih metoda. Odjel za mikrobiologiju hrane za životinje pri VDLUFA-i svoja istraživanja usmjerio je k sistematskom pristupu određivanja mikrobiološke kvalitete baziranom na sadržaju plijesni, kvasaca i bakterija.
Rezultati monitoringa ukazali su da je hrana za životinje izložena kontaminaciji saprofitskim mikroorganizmima na cijelom putu od polja do valova te da stupanj kontaminacije i zastupljenost različitih vrsta mikroorganizama ovisi o vremenu nakon berbe. Znatna kontaminacija je ona primarna, na polju te se stoga za krmiva preporuča da se njima ne hrani najmanje tri mjeseca od kad je ubrano na polju kako bi se smanjio inicijalni broj saprofitskih mikroorganizama koji bi mogli prouzročiti probleme u hranidbi životinja (Gafner, 2012.). S obzirom na veći broj država koje su sudjelovale u monitoringu, istraživanje je dobilo internacionalnu karakteristiku, u početku pod okriljem Internationale Arbeitsgemeinschaft für Futtermitteluntersuchzng (IAG), a kasnije kao European Feed Microbiology Organisation (EFMO), organizaciji koja provodi program razmjene informacije, metoda i noviteta u mikrobiologiji hrane za životinje te organizira međulaboratorijska testiranja mikrobiološke kategorizacije hrane za životinje.
Materijali i metode
Metoda za mikrobiološku kategorizaciju krmiva i krmnih smjesa opisana je u VD LUFA knjizi metoda III. Metoda je opisana u četiri standardne operativne procedure (SOP). 1. Metoda 28.1.1. SOP za brojanje mikroorganizama koristeći krute hranjive podloge, opisuje koje se hranjive podloge koriste u metodi i njihova receptura.
Hranjive podloge koje se koriste jednake su hranjivim podlogama koje se koriste i u ISO normama. Razlika je što se za brojenje bakterija uzorak nacjepljuje na Tryptose agar s trifeniltetrazolium kloridom (TTC).
Pod uvjetima inkubacije (30 °C / 3 dana) bakterije reduciraju, ovisno o aktivnosti metabolizma, TTC u crveni formazan. Na taj način inače bezbojne kolonije postaju kolonije u žutoj, narančastoj (saprofiti), crvenoj ili ružičastoj boji (najčešće indikatori zagađenja) (Slika 1). Broj plijesni u gramu određuje se na hranjivim agarima i DRBC (Slika 2) i DG 18 (Slika 3). Za razliku od ISO standarda u ovoj metodi nasađuju se oba hranjiva agara bez obzira na aktivnost vode (aw), a u obzir se uzimaju vrijednosti s hranjivog agara na kojem je poraslo više kolonija kvasaca i plijesni. 2. Metoda 28.1.2. SOP za brojanje bakterija, kvasaca i plijesni. Brojenje se izvodi isto kako je opisano u ISO 21527-1:2008 i ISO 21527-2:2008 te u ISO 4833:2003. 3. Metoda 28.1.3. SOP za identifikaciju bakterija, kvasaca i plijesni i 4. Metoda 28.1.4. SOP za procjenu mikrobiološke kvalitete.
Prema VDLUFA metodi mikroorga nizmi su podijeljeni u grupe, ovisno u kojoj mjeri mogu narušiti zdravlje životinja. Tako se u 1. i 4. grupi nalaze mikroorganizmi specifični za kontaminaciju na poljima i čiji broj opada skladištenjem. U 2. i 5. grupi se nalaze mikroorganizmi koji se razmnožavaju skladištenjem, dok su u 3 i 7. skupini mikroorganizmi koji svojim prisustvom i u manjem broju narušavaju zdravlje životinja. U zasebnu grupu svrstane su plijesni roda Mucorales koje produciranju micelij u većoj količini od ostalih rodova plijesni te tako onemogućavaju ili usporavaju rast drugim plijesnima, što se u procijeni mikrobiološke kvalitete uzima u obzir (Gafner, 2012.) (Tabela 1).
Financijskom potporom Republike Njemačke VDLUFA provela je veliko istraživanje od 1994. do 1996. s ciljem utvrđivanja orijentacijskih vrijednosti za utvrđivanje mikrobiološke kvalitete krmiva i krmnih smjesa (Gafner, 2012.), a čije se vrijednosti neprestano ažuriraju, ovisno o novim spoznajama. Orijentacijske vrijednosti (OV) izražene su u cfu/g na temelju kojih se krmiva i krmne smjese razvrstavaju u kategorije od 1 do 4. OV postavljene su kao gornji limit sadržaja mikroorganizama za poželjnu kvalitetu za svaki indikacijski mikroorganizam za glavne sastojke krmnih smjesa (žitarice, nusproizvode industrije ulja, sijeno, slama,), najčešće krmne smjese (peletirane i nepeletirane), ovisno o kategoriji životinje (životinje u rastu ili odrasle životinje).
Ako bilo koja grupa indikatorskih mikroorganizama prelazi OV, krmna smjesa ili krmivo prelazi u lošiji razred kvalitete.
U tabeli 2 je prikazan princip po kojem ispitivana krmna smjesa ili krmivo prelazi u lošiju kategoriju, a u tabeli 3 prikazane orijentacijske vrijednosti za pojedine grupe mikroorganizama za kategorizaciju krmnih smjesa za svinje.
Rasprava
Prednost VDLUFA metode leži u tome da ona na objektivan način kategorizira mikrobiološku kvalitetu hrane za životinje uzimajući u obzir o kojem se krmivu radi te o tome za koju je kategoriju životinja namijenjena. Isto tako, u koju će kategoriju ući krmna smjesa ovisi i o tome je li krmna smjesa podvrgnuta termičkoj obradi pri peletiranju te o vrstama mikroorganizama koji se nalaze u smjesi. Stoga nije svejedno ima li u smjesi saprofitskih mikroorganizama ili indikatora zagađenja, jer je za indikatore zagađenja orijentacijska vrijednost (osobito kvasce i plijesni Mucorales) 5 puta manja nego za saprofitske mikroorganizme. U čl. 71 Pravilnika o kakvoći stočne hrane NN 26/98, koji je još uvijek na snazi, pri interpretaciji rezultata orijentacijske vrijednosti za kvasce i plijesni jednake su bez obzira na rod mikroorganizama, osim što postoje orijentacijske vrijednosti za „mlade“ i „odrasle“ kategorije životinje. Pravilnik o kakvoći stočne hrane iz 1998. još uvijek je na snazi jer europsko zakonodavstvo nema određene orijentacijske vrijednosti za mikrobiološku kvalitetu hrane za životinje, već svakoj članici daje da sama odredi kriterije za mikrobiološku kvalitetu hrane za životinje (Zakon o hrani, EC 582/2004).
Jedine smjernice koje propisuje europsko zakonodavstvo u vezi mikrobiološke kvalitete hrane za životinje je Direktiva 25/96 koje kaže da: „Države članice moraju propisati da krmiva mogu prometovati u Zajednici samo ako su nepokvarene, izvornog porijekla i pogodne za prodaju.
Države članice će propisati da se takva krmiva ne mogu predstavljati nikakvu opasnost za zdravlje životinja i ljudi, a ne može se staviti u promet na način koji bi mogli dovesti u zabludu“. I ostale direktive EC 183/2005 i EC 2073/2005 koje se tiču mikrobiološke ispravnosti hrane za životinje te stavljanje iste u promet ne sadrže numeričke orijentacijske vrijednosti.
Proučavajući dostupne zakonske regulative drugih država članica EU, ni jedna država članice nema regulirano zakonom orijentacijske vrijednosti za mikrobiološku kvalitetu hrane za životinje na ovako detaljan način. Orijentacijske vrijednosti propisane su na način kao i u Republici Hrvatskoj (Švedska) ili uopće nisu propisane.
VDLUFA metoda koristi se u zemljama članicama njemačkog govornog područja i Republici Sloveniji u svakodnevnom radu jer postoji veliki interes od proizvođača hrane za životinje i uzgajivača životinja za poznavanjem mikrobiološke kvalitete kao garancije dobrog proizvoda (Gafner, 2012.). U Švicarskoj je metoda prepoznata kao dobra nadopuna nutritivnoj kvaliteti hrane za životinje koja se provodi u sustavu monitoringa hrane za životinje, pri čemu se velika pažnja posvećuje slami kao stelji i krmivu zbog česte povećane kontaminacije sporama plijesni (Wichert i sur., 2008., ALP 2010.). Prednost ove metode je što se za njeno provođenje koriste dobro znane klasične mikrobiološke tehnike.
Možda jedan manji nedostatak je potrebno znanje identifikacije mikroorganizama poraslih na hranjivim podlogama te njihovo pravilno raspoređivanje u pripadajuće grupe. Međutim, za pomoć pri identifikaciji osim opisa pojedinih grupa mikroorganizama u SOP-ovima VDLUFA metoda postoje i preporučeni atlasi za identifikaciju mikroorganizama.
Osim toga, EFMO (Europska organizacija za mikrobiologiju hrane za životinje, www.efmo.org) organizira svake dvije godine sastanke i radionice članova koji primjenjuju ovu metodu na kojima se izmjenjuju iskustva i nova saznanja, a svake se godine organizira i međulaboratorijsko testiranje. Međulaboratorijska istraživanja polučila su velik broj rezultata te se metoda trenutno nalazi u fazi validacije.
Ovom metodom u zadnjih 4 godine u Laboratoriju za mikrobiologiju hrane za životinje pri Hrvatskom veterinarskom institutu analizirano je i kategorizirano preko 100 uzoraka krmiva i krmnih smjesa (Zadravec i sur., 2010., Zadravec i sur., 2011., Zadravec i sur., 2014.).
Rezulati koji su dobiveni ukazuju da na hrvatskom tržištu prevladavaju krmiva i krmne smjese 1. i 2. razreda kvalitete u 70%. Međutim, zabrinjava podatak da je 20% krmiva i krminih smjesa uvršteno u 3. razred kvalitete, a čak 10% ispitivanih uzoraka klasificirano je kao razred 4., kao neupotrebljiva za hranidbu životinja.
Zaključak
S obzirom da je u Republici Hrvatskoj na snazi još uvijek Pravilnik o kakvoći stočne hrane iz 1998. godine koji regulira higijensku ispravnost krmiva i krmnih smjesa, a ni u Europskoj uniji kriteriji za mikrobiološku kvalitetu nisu jasno određeni, VDLUFA metoda mogla bi u budućnosti biti dobra smjernica u osuvremenjivanju higijenskih standarada krmiva i krmnih smjesa u Republici Hrvatskoj. Osim toga, podatak o kategoriji mikrobiološke kvalitete na deklaraciji hrane za životinje povećao bi konkurentnost proizvođača hrane za životinje na tržištu, ne samo u Republici Hrvatskoj nego i u zemljama Europe.
Sažetak
Karakteristika VDLUFA metode je da se pri mikrobiološkoj ispravnosti krmiva i krmnih smjesa ne uzima u obzir samo ukupan broj mikroorganizama (cfu/g) već i njihova potencijalna patogenost. Prema stupnju potencijalne patogenosti bakterije, kvasnice i plijesni razvrstani su u sedam skupina. Na osnovu broja mikroorganizama u pojedinim skupinama krmiva i krmnih smjesa, krmiva i krmna smjese razvrstavaju se u četiri kategorije mikrobiološke kvalitete. S obzirom da je u Republici Hrvatskoj na snazi još uvijek Pravilnik o kakvoći stočne hrane iz 1998. godine koji regulira higijensku ispravnost krmiva i krmnih smjesa, a ni u Europskoj Uniji ne postoje propisane numeričke orijentacijske vrijednosti za mikrobiološku prihvatljivost hrane za životinje, VDLUFA metoda mogla bi u budućnosti biti dobra smjernica u osuvremenjivanju mikrobioloških standarda krmiva i krmnih smjesa u Republici Hrvatskoj, a podatak o kategoriji mikrobiološke kvalitete na deklaraciji hrane za životinje povećalo bi konkurentnost proizvođača hrane za životinje na tržištu.
Literatura [… prikaži]
Microbiological Categorisation of Feed and Feeding Stuffs by VDLUFA Method
Manuela ZADRAVEC, DVM, PhD, Postdoc., Mario MITAK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb; Vesna JAKI TKALEC, DVM, PhD, Postdoc., Darko MAJNARIĆ, DVM, PhD, Scientific Associate, Križevci Veterinary Institute
A characteristic of the VDLUFA method is that the microbiological safety of feed and feeding stuffs takes into account not only the total number of microorganisms (cfu/g), but also their potential pathogenicity. According to the degree of potential pathogenicity of a bacteria, yeasts and moulds were classified into seven groups. Based on the number of microorganisms in certain groups, feed and feeding stuffs are classified into four categories of microbiological quality. In the Republic of Croatia, the Ordinance on the quality of animal feed, in force since 1998, governs the microbiological properties of feed and feeding stuffs. Even in the European Union there are no prescribed numerical reference values for the microbiological acceptability of feed and feeding stuffs, therefore the VDLUFA method could be a good guideline for the future modernization of microbiological standards of feed and feeding stuffs in the Republic of Croatia. Information on microbiological quality on the label of a feed product would increase the competitiveness of feed manufacturers in the market place.
