Molekularna epidemiologija i zoonotski potencijal rotavirusa A dokazanih u ekosustavu Republike Hrvatske

Dragan Brnić, Alen Kovačević, Daniel Čolić, Ivana Šimić, Ines Škoko, Nina Krešić
Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Split, Hrvatska
e-mail: brnic@veinst.hr

Rotavirusi su široko rasprostranjeni enterični patogeni kod sisavaca i ptica. Smatraju se najznačajnijim uzročnicima proljeva kod djece u dobi do pet godina uz više od 200 000 smrtnih slučajeva godišnje, pretežno u zemljama u razvoju. Međutim i u zemljama s visokim higijenskim standardom, uzrokuju značajan morbiditet i postotak hospitalizacija oboljele djece. Osim kod ljudi, važan su uzročnik proljeva i kod mlađih dobnih kategorija životinja, naročito kod prasadi i teladi. Danas poznajemo ukupno devet vrsta (Rotavirus A-D, Rotavirus F-J) roda Rotavirus, porodice Reoviridae. Daleko najznačajnija vrsta je Rotavirus A (RVA) kojoj se u postupku binarne klasifikacije određuje genotip G (VP7 segment) i genotip P (VP4 segment). Do danas je prepoznato ukupno više od 36 genotipova G i 51 genotip P. Rotavirusni genom čini dvolančana RNA molekula podijeljena u ukupno 11 segmenata. Iako su opisani i izravni prijenosi RVA sa životinja na ljude, osnova zoonotskog potencijala ovog virusa je pojava genetskog preslagivanja pojedinih segmenata kod koinfekcija, što uvjetuje pojavu novih, moguće emergentnih, humano-animalnih presloženica.

Cilj ovog istraživanja je odrediti molekularnu epidemiologiju autohtonih sojeva RVA u ekosustavu Republike Hrvatske i procijeniti njihov zoonotski potencijal.

U razdoblju od 2018. do 2020. godine prikupili smo ukupno 2992 uzorka podrijetlom od ljudi (N= 410, RVA pozitivni uzorci fecesa hospitalizirane djece primjenom imunokromatografske metode), domaćih svinja (N= 363), goveda (N= 345), pasa (N= 288), divljih svinja (N= 325), jelena običnog (Cervus elaphus, N= 236), srna (Capreolus capreolus, N= 35), crvenih lisica (Vulpes vulpes, N= 370), europskog čaglja (Canis aureus moreoticus, N= 37), riječnih galebova i galebova klaukavaca (Larus ridibundus i Larus michahellis, N= 293), bijelih roda (Ciconia ciconia, N= 44), površinskih i otpadnih voda (N= 48) te školjkaša (dagnje, Mytilus galloprovincialis; kamenice, Ostrea edulis; brbavice, Venus verrucosa; N=198). Kod domaćih sisavaca pretežno su uzorkovane mlađe dobne kategorije (prasad i telad iz farmskih i dvorišnih uzgoja te štenad iz skloništa za nezbrinute životinje), kod divljih sisavaca odrasle jedinke nakon redovnog lova, a kod divljih ptica podjednako i mlađe i starije dobne kategorije. Od sisavaca i ptica je prikupljen uzorak fecesa ili bris rektuma/kloake, od školjkaša probavna žlijezda i 2 l pojedinog uzorka površinskih ili otpadnih voda.

Virusna RNA je izolirana izravno iz supernatanta suspenzije fecesa/briseva ili nakon provedenog postupka koncentriranja virusa kod uzoraka školjkaša i površinskih/otpadnih voda. Primjenom metode RT-PCR u stvarnom vremenu dokazivali smo prisutnost VP2 segmenta u svim uzorcima osim onih podrijetlom od ptica gdje smo primijenili konvencionalni RT-PCR za dokazivanje VP6 segmenta ptičjih RVA. U postupku određivanja genotipa VP7 (genotip G) i VP4 (genotip P) segmenta RVA koristili smo nekoliko setova početnica za konvencionalni RT-PCR u kombinaciji sa Sanger sekvenciranjem odabranih RT-PCR produkata i/ili u kombinaciji s izravnim genotipiziranjem primjenom konvencionalne multipleks RT-PCR metode. Dobivene sekvence autohtonih sojeva RVA su korištene u filogenetskoj analizi primjenom MEGA X računalnog programa.

Rezultati ukazuju na visoku prevalenciju RVA u uzorcima podrijetlom od domaćih sisavaca (43,2%) i značajno nižu prevalenciju u uzorcima podrijetlom od divljih sisavaca (11,7%). Najniža prevalencija RVA utvrđena je kod galebova obje vrste (1,4%), dok su svi pretraženi uzorci bijelih roda negativni na prisutnost genoma RVA. Kod uzoraka podrijetlom od ljudi potvrđena je prisutnost genoma RVA u 99,5% pretraženih uzoraka. Cirkulacija RVA u okolišnim uzorcima potvrđena je u 20% uzoraka školjkaša i 52% uzoraka površinskih i otpadnih voda. Postupak genotipiziranja VP7 i VP4 segmenta otkrio je iznimno veliku genetsku heterogenost autohtonih sojeva RVA u ekosustavu RH. Utvrđeno je ukupno 15 različitih genotipova G (genotip G1-G6, G8-G12, G15, G24, G34 i jedan moguće novi genotip G) i 18 različitih genotipova P (genotip P[1], P[3]-P[6], P[8]-P[11], P[13], P[14], P[23], P[32], P[33], P[35] i moguće tri nova genotipa P). Najveća genetska raznolikost RVA je iznenađujuće dokazana kod lisica s 10 različitih genotipova G i osam različitih genotipova P, među kojima su iznimno rijedak genotip G15 i svi moguće novi genotipovi G i P. Kada promatramo zastupljenost pojedinih genotipova po vrstama, ona je većinom tipična za vrstu kod goveda i domaćih svinja uz sporadičnu pojavu iznimno rijetkih genotipova kao npr. genotip G24 i P[33] u goveda ili genotip P[32] u domaćih svinja. Kod pasa su prisutni i tipični genotipovi RVA (npr. genotip G3 i P[3]), ali i genotipovi karakteristični za goveda (genotip G6, G8 i P[5]) i domaće svinje (G9 i P[23]). Kod divljih životinja je značajna pojava cirkulacije genotipova tipičnih za domaće životinje, iako treba istaknuti nedostatak podataka o karakterističnim genotipovima RVA kod divljih vrsta životinja uslijed nedostatka sličnih istraživanja. Kod ljudi je razvidna zastupljenost tipičnih humanih genotipova RVA, poglavito kod genotipa P. Rezultati genotipiziranja VP7 segmenta humanih RVA otkrivaju složeniju sliku međuvrsnog prijenosa RVA u prošlosti. Tako primjerice u zadnje dvije rotavirusne sezone genotip G3 prevladava u RH i to klasični humani genotip G3 koji dijeli zajedničkog pretka sa sojevima RVA istog genotipa kod domaćih i divljih svinja, ali i emergentni „equine-like“ genotip G3 koji dijeli zajedničkog pretka sa sojevima RVA kod konja, a mi smo ih dokazali pretežno u okolišnim uzorcima, ali i u uzorku fecesa psa i divlje svinje. Sporadično smo kod djece utvrdili tipično zoonotske genotipove G6, G8, G10 i P[14] karakteristične za goveda, ali je zanimljivo da smo ih osim kod goveda dokazali i kod divljih životinja (G6 i G8 kod jelena običnog; G10 i P[14] kod lisice i europskog čaglja).

Zaključno možemo istaknuti da su RVA visoko zastupljeni u ekosustavu RH te su i dalje značajan uzročnik proljeva kod djece, ali i kod teladi i prasadi. Ovo sinkronizirano molekularno-epidemiološko istraživanje je otkrilo iznimno visoku genetsku raznolikost autohtonih sojeva RVA i ukazalo na učestalu pojavu međuvrsnog prijenosa, kako između različitih vrsta životinja, tako i između životinja i ljudi.
Redovito praćenje RVA u ekosustavu je važan preduvjet za bolje razumijevanje epidemiologije ove bolesti u kontekstu “Jednog zdravlja”.