Nove tehnologije u veterinarskoj medicini – spektrometrija masa

dr. sc. Srđan Vučinić, dr. med. vet.
svucinic@irb.hr

Hrvatska akademija znanosti i umjetnosti / Institut Ruđer Bošković
Laboratorij za sistemsku biomedicinu
Centar za proteomiku i spektrometriju masa

Usporedo sa identifikacijom ljudskog genoma odnosno proteoma, relativno poznata metodologija i instrumentalizacija spektrometrije masa doživljava svoj procvat u području biomedicine kao ključni faktor u identifikaciji novih biomarkera. Razvoj novih eksperimentalnih metoda i usavršavanje postojećih, omogućile su poboljšanja – kako u rezoluciji i osjetljivosti, tako i rasponu mjerenih masa te točnosti sâmih analizatora.

Molekule uzorka se najprije ioniziraju u ionizatoru, potom se ubrzavaju u električnom polju i uvode u odabirač brzine koji se sastoji od električnog i magnetnog polja. Analiza iona na osnovi masene razlike pruža informacije o tipu i rasporedu iona analiziranog uzorka, a za pretragu je dovoljna vrlo mala količina uzorka, svega 10^-12 g. Stoga se ova metoda koristi za kvantifikaciju atoma ili molekula i za dobivanje kemijske i strukturne informacije o analiziranim molekulama.

Osnovni dijelovi spektrometra masa su: ionizator, analizator masa i ionski detektor.
U spektrometru masa analizirani uzorak se uvodi u izvor iona u tekućem ili plinskom stanju, gdje se fragmentira i ionizira. Nastali ioni potom prvo putuju u analizator masa gdje se razdvajaju prema njihovim omjerima m/z, a potom odlaze u detektor koji registrira broj iona pri svakoj vrijednosti m/z što rezultira stvaranjem spektra masa.

Analizatori masa su ključna točka u MS – analizi.
Četiri najčešće korištena analizatora u proteomskim istraživanjima su četveropol (engl. quadrupole), analizator vremena leta (engl. time-of-flight, TOF), ionska stupica (engl. ion trap) i Fourier transformirana ionska ciklotronska rezonancija (engl. Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR).
MALDI je obično povezan s TOF analizatorima koji mjere masu intaktnih peptida, a ESI s analizatorima ionskih stupica i trostrukim četveropolnim analizatorima.

Nadalje, disocijacijom izazvanom sudarima (engl. collision-induced dissociation, CID) s molekulama inertnog plina moguće je dobiti spektre ionskih fragmenata nastalih iz izabranih iona-preteča. Ukoliko je potrebna veća rezolucija (moć razdvajanja) iona nastalih iz molekule nepoznatog uzorka s ciljem strukturne identifikacije uzorka, koristi se tandemski spektrometar masa (MS/MS) koji ima dva ili tri analizatora odvojena tzv. stanicom za sudare (engl. collision cell). Najjednostavnija metoda za strukturnu analizu proteina u proteomskim istraživanjima je identifikacija proteina na temelju određivanja masa njihovih peptidnih fragmenata (engl. peptide mass fingerprinting, PMF). Nepoznati protein se izreže iz 2-DE gela i pocijepa s tripsinom, proteazom koja specifično cijepa proteine na karboksilnom kraju argininskih i lizinskih ostatak. Tako pocijepani proteini različitog amino-kiselinskog slijeda stvaraju seriju masa peptida koja se može detektirati pomoću MALDI–TOF spektrometra masa. Spektar dobivenih masa peptida jedinstven je za svaki pojedini protein poput otiska prsta (engl. mass fingerprint). Usporedbom izmjerenih masa peptidnih fragmenata nepoznatog proteina sa in silico generiranim, pretpostavljenim masama peptida dobivenih teoretskom digestijom proteina s tripsinom u dostupnim proteinskim bazama podataka (npr. Swiss-Prot, http://www.expasy.org/sprot) moguće je identificirati nepoznati protein. Ukoliko protein ne uspijemo identificirati na opisani način (npr. mali kiseli proteini koji ne daju dovoljno peptida nakon digestije tripsinom), tada se jedan ili više peptida fragmentiraju te se im se određuje slijed kratkog amino-kiselinskog odsječka pomoću MS/MS (najčešće spektrometra masa s kvadrupolom i analizatorom vremena leta, Q-TOF MS).

Primjena u veterinarskoj medicini:

• određivanje mase novih spojeva, lijekova, farmaceutika za primjenu u veterinarskoj medicini
• diferencijacija životinjskih vrsta, podvrsta…
• diferencijacija mikroorganizama, bakterija, virusa…
• diferencijacija životinjskih tumora
• kvantifikacija različitih peptida/proteina tj. biomarkera
• visokoprotočna, specifičnija, senzitivnija i točnija dijagnostika
• otkrivanje novih i točnija identifikacija postojećih biomarkera za različita fiziološka/patološka stanja i bolesti (npr. kardiomiopatija ovaca i mačaka, fascioloza ovaca, osteoartritis konja…)

Umjesto zaključka…

---

S obzirom na, još uvijek relativno mali broj životinjskih vrsta kojima je sekvenciran i opisan genom u cjelosti, proteći će još neko vrijeme, za de novo sekvenciranje samih peptida tj. proteina pojedinih životinjskih organizama, potrebno za učinkovitiji razvoj spektrometrije masa kao novog dijagnostičkog sredstva u veterinarskoj medicini.