Određivanje humanog DNA profila na osnovi izuzetog traga s dlake psa

Matea Jurak¹, Gordan Mršić², Josip Crnjac³, Iva Popović⁴, Zrinka Žderić Savatović⁵, Mateja Lozančić², Domagoj Rabić⁴, Martina Ratko², Maja Popović⁶, Ksenija Vlahović⁶, Damir Mihelić⁶, Daniel Špoljarić^6
1 Studentica Integriranog preddiplomskog i diplomskog studija Veterinarskog fakulteta, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska
² Centar za forenzična ispitivanja, istraživanja i vještačenja „Ivan Vučetić“ MUP RH, Zagreb, Hrvatska
³ Sveučilišni odjel za forenzične znanosti, Sveučilište u Splitu, Split, Hrvatska
⁴ Klinika za traumatologiju KBC „Sestre milosrdnice“, Zagreb, Hrvatska
⁵ Studentica doktorskog studija Veterinarska medicina, Veterinarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska
⁶ Veterinarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Izvor: Zbornik radova VETERINARSKI DANI 2015

▲

Sažetak

---

Na životinjskim dlakama mogu se zadržati biološki tragovi. Sporni trag na životinji može se pronaći i nakon dužeg vremenskog perioda. Biološki tragovi životinjskog podrijetla nalaze se u slučajevima u kojima je životinja predmet kaznenog djela ili je korištena kao sredstvo izvršenja kaznenog djela te je stoga važno odrediti DNA profil osobe na osnovu izdvajanja humane DNA molekule. Izuzimani su brisevi prethodno uzorkovane dlake pasa s međulopatičnog područja tijela životinja. U okviru ovog rada korištene su dvije metode za izolaciju molekula DNA – Chelex^® 100 i EZ1^® DNA Investigator Kit. Veći broj djelomičnih DNA profila D2 donora dobiven je izuzimanjem spornog traga sa dlake pasa pomoću sterilnog mokrog vatiranog štapića, te upotrebom EZ1^® DNA Investigator Kit metode za izolaciju DNA molekule.

---

Ključne riječi: DNA identifikacija, pseća dlaka

▲

Uvod

---

Trag je svaka materijalna promjena nastala u vezi s kaznenim djelom. Tragovi upućuju na postojanje kaznenog djela, na način i sredstvo izvršenja, predstavljaju dokaz koji može nezavisno i objektivno povezati osumnjičenog, odnosno žrtvu s objektom ili mjestom kaznenog događaja ili pak povezati osumnjičenog sa žrtvom.

U novije vrijeme sve se češće pridaje važnost pronalasku bioloških tragova koji su u vezi s počiniteljem kaznenog djela, kao što su dlake krzna životinja. Biološki tragovi životinjskog podrijetla najčešće se nalaze u slučajevima u kojima je životinja predmet kaznenog djela (krađa, razbojstvo, krivolov), korištena kao sredstvo izvršenja kaznenog djela (dresirani pas kod krivolova ili krađe stoke), korištena kao sredstvo dolaska i/ili odlaska sa mjesta izvršenja (npr. zaprega), korištena za prijevoz stvari pribavljenih kaznenim djelom (sama ili sa zapregom) ili kao pratilac počinioca kaznenog djela, odnosno kad je sama ili u sklopu zaprege kojom je upravljao čovjek učestvovala u prometnoj nezgodi. U brojnim istraživanjima dokazano je kako životinjska DNA ima jedinstveni genetički kod te je moguće razlikovati životinje unutar iste populacije (PRIMORAC i sur., 2009.). Primjena DNA analize u forenzičnim istragama životinja korištenih za krivolov i ilegalnu trgovinu zaštićenim vrstama u mnogim zemljama se koristi kao dokaz. Pomoću DNA analize moguće je utvrditi vrstu i zemljopisno podrijetlo forenzičnog uzorka te također individualizirati uzorak s visokom razinom vjerojatnosti (IYENGAR, 2014.). Na životinjskim dlakama mogu se zadržati biološki tragovi, a posebno je bitno da se na cijelom tijelu životinje pojedini trag može zalijepiti.

Treba istaknuti da se sporni trag na životinjskim dlakama, ovisno o gustoći i duljini dlake, može pronaći i nakon dužeg vremenskog perioda, ali da ga životinje mogu lako ukloniti ili izgubiti, primjerice lizanjem dlake ili valjanjem po tlu. Životinjska je dlaka jedan od fizičkih dokaza u brojnim i raznolikim slučajevima zločina (GRŠKOVIĆ i sur., 2012.). Pseći uzorci dlake pokazali su se posebno korisni s obzirom na visoku stopu prijenosa koji se prirodno javlja između pasa, ljudi i imovine (OGDEN, 2009.).
Dlaka domaćih životinja lako se lijepi na odjeću i druge predmete te pruža izvor dokaza za kaznene istrage (LYONS i sur., 2014.). Najteži dio rukovanja s tragovima na životinjskim dlakama je upravo njihovo izuzimanje, a da ih se ni na koji način ne uništi.

Najčešći problem s kojim se susrećemo prilikom analize DNA je degradacija DNA molekule i kontaminacija uzorka (ZULIM, 2011.). Često je potrebno biti domišljat i pravovremeno prikupiti trag prije nego bude bespovratno izgubljen pridržavajući se zakonskih okvira koji uvjetuju njegovu valjanost pred sudom. Uz to, važno je zadovoljiti i tri uvjeta koja su bitna za uspješnost forenzične DNA analize. Prvi uvjet je količina uzorka, zbog čega je potrebno prikupiti što je moguće veću količinu traga kako bi se osigurala dovoljna količina DNA za daljnju analizu. Drugo je kakvoća, odnosno stanje traga. Zbog mogućnosti degradacije ili zagađenja bakterijama uslijed dugotrajne izloženosti traga okolišnim uvjetima potrebno je prikupljeni trag što hitnije dostaviti u laboratorij, a do započinjanja rada trag čuvati na hladnom i suhom mjestu. Treći uvjet je čistoća uzorka. Stoga je bitno izbjegavati izuzimanje prljavština i masnoća iz okruženja traga, jer je poznato da takve nečistoće sprečavaju proces analize molekule DNA.

Nakon dostavljanja uzorka koji sadržava biološke tragove u DNA laboratorij, uzorak se pohranjuje i priprema za daljnju analizu. Treba se uzeti u obzir da DNA analiza nedvojbeno ima nezamjenjivu ulogu u sveukupnim forenzičnim znanostima (PROJIĆ i sur., 2013.). Stoga, u predmetnom istraživanju u cilju identifikacije osobe koja je bila u kontaktu sa životinjom, pokušat će se odrediti DNA profil osobe izolacijom humane DNA molekule iz izuzetih briseva dlake psa uzorkovanih s međulopatičnog područja (regio interscapularis) tijela životinje. Jedan od većih izazova kod obrade ovakvog oblika traga je visoki rizik kontaminacije, koja iznimno otežava određivanje jedinstvenog DNA profila unutar miješanog traga.

▲

Materijal i metode

---

U laboratorijima Centra za forenzična ispitivanja, istraživanja i vještačenja „Ivan Vučetić“, Ilica 335, 10 000 Zagreb, pomoću sterilnog vatiranog štapića izuzeli smo briseve sluznice usne šupljine (nesporni biološki trag) od tri donora – D1 (muška osoba), D2 (muška osoba), i D3 (ženska osoba), u svrhu određivanja njihovog nespornog DNA profila. Bris smo izuzimali s unutarnje strane obraza uporabom sterilnog papirnatog štapića. Na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu pomoću nožića za rezanje prikupili smo uzorke dlake od četiri psa (križanci, muškog i ženskog spola, uz prethodnu dozvolu vlasnika) i to sa međulopatičnog područja (regio interscapularis) tijela životinja (dozvola Etičkog povjerenstva Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu klasa: 640-01/15-17/9, ur. broj: 251-61-01/139-15-1) (Slika 1). Potom su uzorci dlake zapakirani u papirnate omote i dostavljeni u laboratorije Centra „Ivan Vučetić“. Za vizualizaciju strukture prikupljenih uzoraka dlaka životinja koristili smo komparativni mikroskop LEICA FS CB – DM 2500 (kamera LEICA DFC-295, program za obradu slike LEICA LAS Core V3) i skenirajući elektronski mikroskop (SEM Philips XL 30 s EDX detektorom) (Centar „Ivan Vučetić“). Neposredno prije mikroskopiranja uzorke dlake smo obrisali sterilnom vatom namočenom u 20 %-tni etanol (Kemika, Hrvatska).

U laboratorijima Centra „Ivan Vučetić“, svaki donor je četvrtinu ukupnog uzorka dlake svake životinje trljao između prstiju u trajanju od 10 sekundi kako bi epitelne stanice sa prstiju donora zaostale na dlaci. Na taj način svaki donor je protrljao četiri uzorka dlake, nakon čega smo od svakog uzorka izuzeli po četiri brisa pomoću sterilnih vatiranih štapića. Naime, po svakom protrljanom uzorku dlake izuzeli smo po dva suha brisa (suhi sterilni vatirani štapić) i dva mokra brisa (sterilni štapić navlažen ultrafiltriranom vodom). Između izuzimanja pojedinog brisa radili smo pauzu od pet minuta unutar koje je uzorak dlake ponovno protrljan između prstiju. Na taj način prikupili smo 48 spornih bioloških tragova, odnosno po svakom donoru 16 spornih bioloških tragova (8 suhih briseva dlake podrijetlom od 4 psa, 8 mokrih briseva dlake podrijetlom od 4 psa). Kontrolnim uzorcima dlake svake životinje, nakon što smo ih obrisali sterilnom vatom namočenom u 20 % etanol (Kemika, Hrvatska) izuzeli smo po svakoj životinji dva suha i dva mokra brisa (ukupno 16 kontrolnih briseva od čega četiri po svakoj životinji). Ukupno izuzete sporne biološke tragove (48) podijelili smo u dvije skupine (A i B), s po 24 brisa dlake, ovisno o metodi izolacije molekule DNA. U uzorcima skupine A (skupina je sadržavala izuzeti jedan suhi i jedan mokri sporni biološki trag dlake po svakom donoru, podrijetlom od po četiri psa) izolaciju DNA molekule radili smo upotrebom anorganske metode Chelex^® 100 reagensa (5 % otopina Chelex-a = Chelating Ion Exchange Resin). Uzorcima skupine B (skupina je sadržavala izuzeti jedan suhi i jedan mokri sporni biološki trag po svakom donoru dlake, podrijetlom od po četiri psa) izolaciju DNA molekule radili smo upotrebom EZ1^® DNA Investigator Kit-a (Qiagen) za izolaciju DNA na uređaju EZ1^® Advanced XL (Qiagen). Kontrolnim uzorcima (ukupno 16) molekulu DNA izolirali smo upotrebom Chelex^®100 metode.

U laboratorijima Centra „Ivan Vučetić“, količinu izolirane DNA u svakom uzorku odredili smo metodom qRT-PCR (kvantitativna reakcija PCR-a u stvarnom vremenu) upotrebom Quantifiler^® Human DNA Quantification Kit-a (Applied Biosystems, 2006) na 7500 Real Time PCR System uređaju (Applied Biosystems, 2005). Umnažanje DNA uzoraka napravili smo korištenjem AmpFlSTR^® NGMTM PCR amplification kit-a (Applied Biosystems, SAD) za umnažanje 15 humanih mikrosatelitnih lokusa (STR – kratke uzastopno ponavljajuće sekvence): D10S1248, vWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D22S1045, D19S433, TH01, FGA, D2S441, D3S1358, D1S1656, D12S391 i biljega spola amelogenin na GeneAmp^® PCR System 9700 (Applied Biosystems), prema uputama proizvođača. Analizu umnoženih dijelova DNA molekule iz izuzetih briseva odradili smo na uređaju 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) za kapilarnu elektroforezu, a rezultate smo analizirali upotrebom GeneMapper ID-X ver.1.4. (Applied Biosystems) programa sa visinom vrha na genskom lokusu u vrijednosti većoj od 75 RFU (eng. relative flourescence units). Iz izuzetih nespornih bioloških uzoraka tri donora napravili smo DNA analizu čije smo rezultate koristili za usporedbu s profilima dobivenima iz spornih briseva dlake pasa.

▲

Rezultati

---

Mikroskopiranjem uzorka pseće dlake pomoću komparativnog mikroskopa jasno je vizualiziran njezin tanki i glatki površinski sloj (cuticula) te tamnije pigmentirana srž (medula) koja je građena po obliku i veličini od podjednakih zračnih komorica (Slika 1A). Vizualizacijom ultrastrukture kutikule uzorka pseće dlake pomoću elektronskog mikroskopa vidljive su keratinske ljuskice pravilnog i izduženog oblika koje prekrivaju površinu dlake nalik na izgled kore ariša. Naime, rubovi keratinskih ljuskica naliježu jedna na drugu poput crijepova krova čineći je pritom glatkom. Tako su na površini dlake vidljive samo malobrojne epitelne stanice koje su se prihvatile tijekom trljanja dlake među prstima jednog od donora u istraživanju (Slika 1B).

U Tablici 2 prikazani su dobiveni nesporni DNA profili triju donora kojima je DNA izolirana iz briseva bukalne sluznice upotrebom Chelex^® 100 metode. U tablici je naveden broj ponavljajućih humanih mikrosatelitnih tetranukleotidnih sljedova (alela) za pojedini lokus. Dobiveni DNA profili donora uspoređeni su s rezultatima analize 48 sporna brisa dlake podrijetlom od četiri križana psa, pri čemu je na 24 sporna brisa provedena DNA izolacija Chelex^® 100 metodom (Tablica 3), a na preostala 24 sporna brisa izolacija je provedena upotrebom EZ1^® DNA Investigator Kit-a (Tablica 4). Analizom umnoženih dijelova DNA iz spornih tragova na uređaju 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) za kapilarnu elektroforezu, te upotrebom GeneMapper ID-X ver.1.4. (Applied Biosystems) programa sa visinom vrha na genskom lokusu u vrijednosti većoj od 75 RFU, uporaba EZ1^® DNA Investigator Kit-a pokazala se kao uspješnija metoda izolacije DNA iz spornih tragova na dlaci pasa i to izuzetih pomoću mokrih sterilnih vatiranih štapića (Tablica 3).

▲

Rasprava

---

DNA analiza jedna je od najpouzdanijih biometrijskih metoda identifikacije koja u forenzičnim znanostima ima značajnu ulogu u istraživanju kaznenih radnji, utvrđivanju identiteta jedinki i dokazivanju srodstva pri čemu se koriste unaprijed određeni lokusi, za koje je poznato da sadrže određene parove baza koji se uzastopno ponavljaju, a istodobno pokazuju veliku varijabilnost u ljudskoj populaciji (RADMILOVIĆ, 2008.).

Upravo ovom metodom rasvijetljeni su brojni sudskomedicinski slučajevi širom svijeta (CAR, 2012.). S obzirom na činjenicu da se slijed nukleotida DNA između jedinki iste vrste razlikuje u svega 0,5 do 1 % s velikom se sigurnošću može tvrditi da svaka jedinka (osim jednojajčanih blizanaca) ima svoj jedinstveni DNA profil, koji time može povezati osumnjičenika i pronađeni trag (PRIMORAC i sur., 2009.). U slučajevima u kojima se profil mogućeg donora i sporni profil podudaraju računa se vjerojatnost konkretnog podudaranja (PRIMORAC i sur., 2009.). Mikrosateliti su (od eng. short tandem repeats, STR-lokusi) najvažniji i najpogodniji genetski biljezi u molekularno-genetskim istraživanjima budući da su visoko polimorfni i pogodni za individualnu tipizaciju DNA, odnosno izradu genetskog profila jedinke. Mikrosateliti predstavljaju kratke ponavljajuće nukleotidne nizove (od 2 do 6 nukleotida), primjerice (TG) n ili (AAT) n , ravnomjerno razdijeljene po genomu na više od sto tisuća lokusa. Brojni su u eukariotskim genomima i često su vrlo polimorfni zbog različitog broja jednostavnih ponavljajućih sljedova. Pojavljuju se i kod prokariota, ali s manjom učestalošću. Rijetko sadrže više od 70 ponavljajućih jedinica, a nalaze se po cijelom genomu. Procijenjeno je da se u sisavaca najčešći slijed nukleotida GT/CA pojavljuje u prosjeku svakih 30 kb (kilobaza). Proučavanjem STR/mikrosatelitnih lokusa ustanovljeno je da se broj ponavljanja određenog STR/mikrosatelitnog slijeda razlikuje od jedinke do jedinke čime je moguće identificirati njihov genetički profil. Mikrosatelitni (STR) lokusi raspršeni su po genomu svake jedinke i ponavljaju se svakih 20 kb, a važno obilježje je i njihova raznolikost zbog koje imaju sve veću primjenu u genskom mapiranju, populacijsko-genetičkim studijama, evoluciji, forenzici te prenatalnoj dijagnostici.

Važna obilježja ovih lokusa za forenzična istraživanja su izražena učestalost heterozigotnosti, jasno definirani ponavljajući sljedovi i alelne varijante te jednostavno umnažanje. Tetranukleotidni mikrosatelitni (STR) lokusi danas imaju najveću primjenu u forenzičnoj analizi. Rezultati s visokim indeksom isključivanja dobivaju se analizom tetranukleotidnih i pentanukleotidnih mikrosatelitnih (STR) lokusa koji su uključeni u komercijalne multipleksne setove. U suglasnosti s prethodno navedenim da svaka jedinka ima jedinstveni genetički zapis su i rezultati ovog istraživanja u okviru kojeg su određeni nesporni DNA profili tri donora korištenjem AmpFlSTR^® NGMTM PCR kita (Applied Biosystems, USA) za umnaženje 15 humanih mikrosatelitnih lokusa (STR lokusi) i biljega spola amelogenin na GeneAmp^® PCR System 9700 (Applied Biosystems) uređaju. S obzirom da je jedan od osnovnih uvjeta uspješnosti detekcije DNA profila prikupljena dovoljna količina traga (GRŠKOVIĆ i sur., 2014.), u ovom radu na osnovi vizualizacije SEM-om mnogobrojnih epitelnih stanica donora možemo zaključiti da smo zadovoljili taj uvjet. U veterinarskoj forenzici morfološke analize osobitosti dlaka vrsta i pasmina domaćih i divljih životinja mogu poslužiti kao ključni potkrepljujući dokazi u istragama takvih slučajeva (GRŠKOVIĆ i sur., 2012.). Nerijetko DNA laboratoriji eksperimentiraju te kombinacijom različitih tehnika i primjenom izmijenjenih standardnih postupaka izdvajanja i pročišćavanja izolirane DNA nastoje prevladati prethodno navedeni problem. S obzirom da je postupak izdvajanja molekule DNA iz stanice ključni i najosjetljiviji korak u procesu uspješnog dobivanja DNA profila, u ovom radu sporni su tragovi izuzimani s pomoću suhog i mokrog vatiranog sterilnog štapića. Nadalje, na osnovi literature poznata je činjenica da znanstvenici nastoje unaprijediti proces identifikacije usavršavanjem postupaka izolacije DNA i to prvenstveno ovisno o tipu izuzetog biološkog traga. Tako su i u okviru ovog rada korištene dvije metode za izolaciju molekule DNA. Analizom dobivenih rezultata, EZ1^® DNA Investigator Kit pokazao se kao učinkovitiji način izolacije DNA iz spornih tragova ljudskih epitelnih stanica s dlake pasa i to izuzetih pomoću mokrih sterilnih vatiranih štapića. Uspoređivanje dobivenih DNA profila analizom spornih uzoraka sa nespornim DNA profilom donora identificirana je osoba koja je navedeni trag ostavila na uzorku dlake. Međutim, prilikom DNA identifikacije vrlo je značajan „indeks vjerojatnosti“ koji opisuje koliko je puta vjerojatnije da je referentna osoba ostavila trag od vjerojatnosti da je to učinila nasumično odabrana osoba iz populacije. Takva se vjerojatnost smanjuje kod djelomičnih DNA profila, u kojima dolazi do izostanka detekcije jednog ili više alela. Najčešći uzrok pojavi djelomičnog profila u forenzici je nedostatna početna količina DNA u tragu. U našem radu dobili smo djelomične DNA profile donora iz traga epitelnih stanica na dlaci pasa. Tako je veći broj djelomičnih DNA profila D2 donora, u kojem nedostaje jedan do dva alela u svega nekoliko lokusa, dobiven upotrebom EZ1^® DNA Investigator Kit metode za izolaciju DNA molekule.

Dobiveni rezultati ukazuju na mogućnost izolacije DNA iz vrlo oskudnih tragova epitelnih stanica zaostalih na dlaci životinje. Unatoč dobivenim djelomičnim profilima, dobiveno je dovoljno podataka za identifikaciju donora traga. To otvara mogućnost identifikacije počinitelja kaznenih djela nad životinjama koje se sve češće opisuju u javnim medijima. Na internet portalu Slobodne Dalmacije od 04.03.2015. objavljen je članak pod naslovom „Lešine 50 ovaca bacio pokraj Cetine: Životinje su bile neishranjene, nema govora o bolesti“. Također, 30.04.2014.na internet portalu Dnevnik.hr objavljen je članak pod naslovom „Pucao u psa i bacio ga u kanal: Lovcu kaznena prijava za mučenje životinja!“. Tragovi životinjskog porijekla mogu biti značajni za slučajeve okrutnosti prema životinjama, ali oni također mogu poslužiti kao dokaz koji može povezati ljude sa mjestom zločina ili sumnje na žrtvu (LABONTE i sur., 2013.).

Literatura [… prikaži]

▲

Determination of human DNA profile based on exempted traces with dog hair

---

Matea Jurak, Gordan Mršić, Josip Crnjac, Iva Popović, Zrinka Žderić Savatović, Mateja Lozančić, Domagoj Rabić, Martina Ratko, Maja Popović, Ksenija Vlahović, Damir Mihelić, Daniel Špoljarić

---

Biological traces can retain on animal hair. Disputable traces can be found on animals even after a long period of time. Biological samples of animal origin can be found in cases where the animal is the subject of a criminal offense, or is used as an object in committing a crime and it is therefore important to determine the DNA profile of the suspect. Donor DNA profiles were extracted from swabs collected from dog hair samples, which were sampled from the interscapular area. In this paper two methods were used for the isolation of DNA – Chelex^®100 and EZ1^® DNA Investigator Kit.
The analysis of obtained results showed that both methods were successful and gave partial DNA profiles. However, EZ1^® DNA Investigator Kit provided more partial profiles with a greater number of detected alleles than did the Chelex® 100 method.
Also, extraction was more successful from samples obtained through the use of sterile wet cotton sticks.
Key words: DNA identification, dog hair

• Radionica u Hrvatskom veterinarskom institutu u sklopu IAEA/FAO projekta
• Primjene CRISPR/Cas9: pregledni članak
• Hrvatski veterinarski institut otvorio novu jedinicu za molekularnu dijagnostiku i istraživanje virusnih infekcija
• Nova generacija sekvenciranja u veterinarskoj medicini – pregled II. dio
• Nova generacija sekvenciranja u veterinarskoj medicini – pregled I. dio