Nina Bilandžić, Đurđica Božić, Antonija Vrbić, Ivana Varenina, Božica Solomun Kolanović, Marija Sedak i Maja Đokić
Dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, Đurđica BOŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., Antonija VRBIĆ, dipl. ing. biotehnol., Ivana VARENINA, dipl. ing. biotehnol., Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, dipl. ing. prehr. tehnol., Marija SEDAK, dipl. ing. prehr. tehnol., Maja ĐOKIĆ, dipl. ing. kem. tehnol., Hrvatski veterinarski institut, Zagreb.
UvodMaterijal i metodeRezultati i raspravaSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
Pri intenzivnoj proizvodnji životinja primjena antibakterijskih lijekova je postala važan čimbenik javnog zdravstva.
Povećana primjena lijekova pokazala je mnoge neželjene utjecaje na zdravlje ljudi, kao što su pojačavanje mikrobne rezistencije i time povećanje rizika od infekcija kada patogena bakterija rezistentna na određeni antibiotik uđe u prehrambeni lanac te hiperosjetljivost i promjene u crijevnoj mikroflori (Cerniglia i Kotarski, 2005.). Jedan od antibiotika je i trimetoprim (TMP, 2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoksibenzil) pirimidin), sintetički antibakterijski lijek koji sprječava sintezu folne kiseline u bakterija (White i sur., 1981.). Danas se TMP koristi u kombinaciji sa sulfonamidima čime se povećava njihovo međusobno djelovanje, odnosno povećava spektar djelovanja protiv brojnih patogenih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija kao što su Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp., E. coli, Salmonella spp. i druge te protozoa i rikecija.
Stoga se prah i suspenzije sulfonamida s TMP koriste u domaćih životinja te tako i u prevenciji i liječenju peradi, odnosno kokoši za uzgoj, tovnih pilića i pura (Einestein i sur., 1994.). Najčešće korištene kombinacije u veterinarskoj medicini su TMP i sulfadiazin te TMP i sulfametoksazol (Pereira i Cass, 2005.).
Najviše dopuštene količine TMP u tkivima peradi, odnosno mišiću, jetri i bubregu su 50 μg/kg (EC, 2010.).
Korištenje TMP i sulfonamida je zabranjeno u nesilica te se jaja tretiranih kokoši ne smiju koristiti u prehrani ljudi.
Na velikim peradarskim farmama mogu postojati situacije u kojima može doći do nenamjerne primjene TMP pri rukovanju kao što su hranjenje neiskorištenom količinom obroka hrane ili davanje vode koja je namijenjena za tovne piliće ili kokoši za tov (Atta i El-zeini, 2001.). Stoga je najčešći uzrok ostataka tih lijekova u jajima posljedica lošeg upravljanja hranom i nepoštovanje vremena karence lijeka (JECFA, 2004.).
Nakon primjene u kokoši nesilica te apsorpcije u crijevima lijek se krvlju transportira te se ostatci lijeka izlučuju u žumanjku ili bjelanjku ili u oba, što je određeno fizikalnim svojstvima lijeka te fiziologijom kokoši i postupku formiranja jaja (Donoghue i Myers, 2000.). Svega je nekoliko istraživanja dostupno s rezultatima izlučivanja TMP u jajima (Nagata i sur., 1991., Atta i El-zeini, 2001.).
Prisutnost ostataka u hrani je potencijalni faktor rizika zbog toksikoloških i kancerogenih utjecaja na ljude (EMEA, 1995.). Utvrđeno je da TMP može utjecati na promjene u koštanoj srži te na težinu
pojedinih organa u ljudi i životinja (Li i sur., 2013.).Cilj ovog istraživanja je utvrđivanje eliminacije TMP iz jaja, odnosno žumanjka nakon primjene lijeka vodom za piće u kokoši nesilica. Koncentracije TMP određivane su tekućinskom kromatografijom s masenom detekcijom.
Materijal i metode
Tretman nesilica i uzorkovanje
Ukupno 15 kokoši nesilica (ISA Brown) starosti oko 21 tjedana nasumično je podijeljeno u dvije skupine u odvojene kaveze, eksperimentalnu (n=10) i kontrolnu (n=10). Kokoši su hranjene uravnoteženom prehranom hrane za nesilice te imale slobodan pristup svježoj vodi. Nesilice su dnevno uzimale ad libitum prosječno 225 mL vode. Prije primjene lijeka, životinje su izvagane te im je utvrđena prosječna težina od 1,65 kg. Eksperimentalna skupina nesilica zaprimala je kemoterapeutik Trisulfon prašak, kombinirani lijek sulfamonometoksin/TMP (Krka, Slovenija) u terapeutskoj koncentraciji od 8 g/L tijekom 7 dana (aktivna koncentracija: 40 mg/g sulfamonometoksin i 20 mg/g TMP). Stoga je dnevna doza TMP u vodi 160 mg/L što odgovara izloženosti od 21,8 mg TMP/kg tjelesne težine/dan.
Jaja su prikupljana prvih pet dana te zatim svakog petog dana (10., 15., 20., 25., 30. i 35.) nakon završetka tretmana.
Isto su tako uzorci kontrolne skupine prikupljeni paralelno te korišteni za kontrolu kakvoće određivanja TMP u jajima. Jaja su označena te dopremana u laboratorij gdje su pohranjena na +4 °C. Za određivanje TMP u žumanjku jaja uzimano je po 5 jaja (za dva određivanja) kojima je odijeljen bjelanjak od žumanjaka te su uzorci žumanjaka homogenizirani. Uzorci su pohranjeni i zamrznuti na -20 °C do analize.
Otapala, reagensi i standardi
Diklormetan bez etanola kao stabilizator (HPLC čistoće), metanol (LC – MS razred) i kolonice za kruto-faznu ekstrakciju (SPE) s aromatskom sulfonskom kiselinom (SO3H) od 500 mg po 3 mL su nabavljeni od J. T. Baker (Deventer, Nizozemska). Svi korišteni reagensi su HPLC ili LC-MS analitičke čistoće. Aceton (HPLC čistoće) je nabavljen od tvrtke Merck (Darmstadt, Njemačka), a natrijev sulfat (bezvodni) od Carlo Erba (Milano, Italija). Amonijev formijat (97%), octena kiselina min 99,8% te mravlja kiselina (ACS reagens ≥ 96%) su nabavljeni od Sigme Aldrich (Chemie GmbH, Njemačka). Natrijev klorid i otopina amonijaka 25% kupljeni su od Kemike (Zagreb, Hrvatska). Dušik 5,0 i 5,5 je nabavljen od SOL spa (Monza, Italija). Ultra čista voda (18 MΩxcm) dobivena je pomoću sustava NIRO VV UV UF 20 (Nirosta doo tehnologija vode, Osijek, Hrvatska).
Standard trimetoprima (TMP) nabavljen je iz Sigme-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Bazna otopina trimetoprima pripravljena je u koncentraciji od 1000 μg/mL u metanolu te je razrijeđena sto i deset puta u metanolu za pripravljanje radnih otopina. Radne koncentracije su korištene za točke standardne krivulje te obogaćivanje uzoraka jaja.
Instrumenti
U pripremi uzorka korištena je sljedeća oprema: blender model 7011HS (Waring Komercijalni, Connecticut, SAD), homogenizator Politron model T -2000 (Kinematica, Inc., Švicarska), mješalica Minishaker MS2 (IKA® – Werke GmbH & Co KG, Staufen, Njemačka), ultrazvučna kupelj Iskra (ISKRA PIO, Slovenija), mnogostruki vakum sustav Supelco (Supelco Inc, Bellefonte, PA), centrifuga Rotanta 60R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Njemačka) i sustav za uparavanje dušikom N-EVAPTM Model 112 (Orgamonation Associates Inc, SAD).
Analiza TMP je provedena tekućinskom kromatografijom vezanom sa spektrometrijom masa LC-MS/MS primjenom sustava HPLC 1200 i masenog spektrometra TripleQuad LC/MS 6410 (Agilent, SAD).
Priprema uzoraka
Odvagne se 10 g homogeniziranog žumanjka te se doda interni standard.
Za ekstrakciju doda se 50 mL acetona/diklormetan (1:1, v/v) te promiješa 1 minutu. U svrhu uklanjanja vode iz smjese doda se 10 g natrijevog klorida i 10 g natrijevog sulfata. Nakon svakog dodavanja uzorak miješati 30 sekundi.
Nakon centrifugiranja (3000 x g, 5 minuta) uzme se 5 mL bistrog nadtaloga te doda 250 μL octene kiseline uz miješanje. SPE kolonice se kondicioniraju dva puta s 5 mL mješavine aceton/diklormetan/octena kiselina (47,5:47,5:5, v/v). Uzorak se kvantitativno prenese na filtracijsku kolonu te se ispire dodatkom 5 mL vode i 5 mL metanola. Eluat se sakuplja u novu konusnu epruvetu te eluira s 5 mL mješavine metanola i 2,5% amonijaka.
Zatim se uzorak upari do suhoga u struji dušika pri 50 ± 5 °C. Ostatak se otopi u 100 μL metanola i 100 μL mobilne faze A te promiješa. Prije injektirnja u LC-MS/MS sustav uzorak se filtrira kroz celulozni membranski filter veličine pora 0,45 μm.
Kromatografski i MS parametri
Kromatografsko razdvajanje postignuto je s primjenom gradijenta na koloni X Terra RP18 Waters 4,6 x 150 mm, 3,5 um (Waters, SAD) pri temperaturi od 40 °C. Mobilna faza se sastoji od otopine (A) 5 mM amonijevog formijata koja se zakiseli na pH 3,5 s mravljom kiselinom te otopine (B) 5 mM amonijevog formijata u metanolu. Gradijentno eluiranje počinje s 0% B faze te linearno raste na 100% od 10 do 12,10 min, nakon čega do 16 min je ponovno na 0% te se kolona stabilizira dodatne 3 minute protokom mobilne faze u početnom stanju. Protok mobilne faze je 0,6 mL/min i volumen injektiranja uzoraka 15 uL.
Trostruki se kvadrupol maseni spektrofotometar sastoji od ESI izvora iona, a ionizacija elektroraspršenjem TMP se odvija u pozitivnom modulu.
Temperatura plina iznosi 350 °C, a protok plina je 11 L/min i napon kapilare 4000 V.
Validacija metode
Validacija metode provedena u skladu s kriterijima propisanim odlukom komisije 2002/657/EC (Europska komisija, 2002.). Specifičnost je testirana analizom 20 uzoraka jaja. Određeni su najvažniji parametri koji opisuju izvedbene sposobnosti metode: CCβ, sposobnost dokazivanja; CCα, granična koncentracija analita; LOD, granice određivanja metode; LOQ, granica kvantifikacije; iskorištenje metode.
Granica određivanja metode LOD i granica kvantifikacije LOQ izračunaju se tako da se srednjoj vrijednosti određenoj za 20 slijepih uzorka jaja pribroje 3, odnosno 10 puta standardna devijacija određena za te uzorke. Granična koncentracija određivanja CCα određena je obogaćivanjem uzoraka u 3 serije po 6 uzoraka na 2,5 μg/kg te je izračunata kao zbroj vrijednosti najniže koncentracije validacijskog postupka (C0) i standardne devijacije pri C0 (Sr/C0) pomnožene s 2,33.
Sposobnost dokazivanja CCβ izračuna se kao zbroj vrijednosti CCα i standardne devijacije pri CCα pomnožene s 1,64.
Iskorištenje metode određeno je obogaćivanjem uzoraka jaja s TMP u tri serije na 3 koncentracijske razine (2,5, 5 and 10 μg/kg) po 6 ponavljanja.
Statistička analiza
Statistička je analiza provedena programom Statistica® 6.1 (StatSoft® Inc., Tulsa, SAD). Koncentracije TMP određene u žumanjku jaja izražavane su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD).
Rezultati i rasprava
U peradarskoj industriji primjena veterinarskih lijekova, odnosno TMP može dovesti do prisutnosti ostataka u jajima. Utvrđeno je da TMP u ljudi izaziva gastrointestinalne poremećaje (mučnina, povraćanje), osip i pad hematopoeze te da je kontraindiciran u trudnoći, kod novorođenčadi te pri oštećenju bubrega (EMEA, 1997.).
Ova se studija temelji na pretpostavci da se TMP može povremeno i slučajno ili namjerno koristiti u nesilica primjenom vode za piće koje je namijenjena pilićima te da se ostatci TMP mogu zadržati kroz više tjedana u jajima nakon primjene.
Trimetoprim je određivan u žumanjku jaja pomoću osjetljive LC-MS/MS metode koja je validirana u skladu s Direktivom Vijeća 2002/657/EC. 
± SD, μg/kg) u žumanjku jaja tijekom 35 dana
nakon administracije lijeka vodom 7 dana u
koncentraciji od 8 g/L.
U prijašnjim istraživanjima ostatci sulfonamida su određivani u jajima (Romvary i Simon, 1992., Furusawa i sur., 1998., Roudaut i Garnier, 2002., Vandenberge i sur., 2012.). Međutim, svega dva istraživanja odnose se na određivanjem ostataka TMP u jajima (Nagata i sur., 1991., Atta i El-zeni, 2001.).
Za razliku od ove studije koncentracije u kojoj su TMP koncentracije pale ispod 100 μg/kg tek između 15. i 20. dana nakon tretmana, većina prijašnjih studija sugerira da je vrijeme zadržavanja TMP u
jajima od 9 do 11 dana.
Primjenom TMP u kokoši nesilica u koncentraciji od 4, 16 and 56 mg/kg (ppm) u hrani za nesilice kroz 19 dana utvrđeno je da su ostatci TMP uglavnom utvrđeni u žumanjku jaja pri primjeni sve tri koncentracije. Ostatci TMP u žumanjku i bjelanjku jaja ispod granice detekcije od 0,02 ppm određeni su 4., 9. i 11. dana nakon prestanka uzimanja lijeka (Nagata i sur., 1991.). U istraživanju eliminacije TMP iz jaja nakon primjene TMP u dozi od 0,2 i 0,4 g/L u vodi tijekom pet dana maksimalne koncentracije TMP u žumanjku postignute su dan nakon prestanka tretmana: 0,43 i 0,81 μg/g (Atta i El-zeni, 2001.). Koncentracije TMP u žumanjku su pale ispod granice određivanja metode od 0,02 μg/g 5., odnosno 7. dana nakon tretmana.
Zaključno, primjena TMP u vodi za piće u kokoši nesilica uzrokuje ostatke lijeka u jajima, odnosno žumanjku jaja koji su mjerljivi i 35 dana nakon završetka tretmana. Ovo istraživanje je pilot studija istraživanja eliminacije kombiniranog pripravka TMP/sulfonamid u jajima nakon primjene više koncentracija.
Daljnja će se istraživanja provesti sa svrhom određivanja omjera ostataka TMP u žumanjaku i bjelanjku jaja.
Sažetak
Trimetoprim, sintetički antibakterijski lijek danas se najčešće koristi u kombinaciji sa sulfonamidima u svrhu spriječavanja infekcija brojnih patogenih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija.
Njegova primjena je zabranjena u kokoši nesilica. Ovo istraživanje simulira slučajnu ili namjernu primjenu trimetoprima u nesilica u vodi za piće. Trimetoprim je davan kokošima u koncentraciji od 8 g/L u vodi za piće tijekom 7 dana, odnosno dnevna doza u vodi bila je 160 mg/L. Koncentracije trimetoprima određene su u žumanjcima jaja prvih pet dana te zatim svakog petog dana do 35. dana nakon završetka tretmana. Trimetoprim je određivan primjenom LC-MS/MS metode koja je validirana u skladu s Direktivom Vijeća 2002/657/EC. Određeni su parametri validacije: CCβ 2,8 μg/kg; CCα 3,1 μg/kg, LOD 0,3 μg/kg, LOQ 1,2 μg/kg te iskorištenje 99,7%. Najviša koncentracija trimetoprima 6165,1 μg/kg određena je treći dan nakon završetka primjene lijeka. Dolazi do brzog pada koncentracija nakon tretmana te je 5. dana koncentracija trimetoprima bila 1442,8 μg/kg, a 15. dana svega 227,2 μg/kg, a 30. dana ispod granične koncentracije određivanja metode od 2,8 μg/kg. Zadnjeg 35. dana određivanja koncentracija je još iznad granice kvantifikacije metode od 1,2 μg/kg. Daljnja istraživanja potrebno je provesti sa svrhom određivanja omjera ostataka trimetoprima u žumanjaku i bjelanjku jaja.
Literatura [… prikaži]
Trimethoprim residues in egg yolk after administration in laying hens
Nina BILANDŽIĆ, PhD, Grad. Biotechnology Eng., Scientific Advisor, Đurđica BOŽIĆ, Grad. Biotechnology Eng., Antonija VRBIĆ, Grad. Biotechnology Eng., Ivana VARENINA, Grad. Biotechnology Eng., Božica SOLOMUN KOLANOVIĆ, Grad. Biotechnology Eng., Marija SEDAK, Grad. Food Technology Eng., Maja ĐOKIĆ, Grad. Chem. Technology Eng., Croatian Veterinary Institute Zagreb
Trimethoprim, a synthetic antibacterial drug, is most commonly used in combination with sulfonamides in order to prevent infection by many pathogenic Gram-positive and Gram-negative bacteria. Its use is prohibited in laying hens. This study simulated the accidental or deliberate administration of trimethoprim in laying hens via drinking water. Trimethoprim was administered to chickens at a concentration of 8 g/L in water for 7 days, and the daily dose in water was 160 mg/L. Concentrations of trimethoprim were determined in egg yolks for the first five post-treatment days and then every fifth day until the 35th days after completion of the treatment. Trimethoprim was determined using the LC-MS/MS method validated in accordance with Council Directive 2002/657/EC. The parameters of validation were: CCβ 2.8 μg/kg, CCα 3.1 μg/kg, LOD 0.3 μg/kg, LOQ 1.2 μg/kg, recovery 99.7%. The highest concentration of trimethoprim (6165.1 μg/kg) was determined on the third day after administration of the drug. There was a rapid drop in concentration after treatment, with the concentration of trimethoprim at 1442.8 μg/kg on the 5th post-treatment day, 227.2 μg/kg on the 15th post-treatment day, and below 2.8 μg/kg, the level of limit of decision of the method, on the 30th post-treatment day. On the final 35th day of measurement, the concentration was still above the limit of quantification of 1.2 μg/kg. Further research should be carried out with the purpose of determining the ratio of trimethoprim residues in egg yolk and white.