Povezanost invazije parazita Giardia duodenalis s pokazateljima hematoloških i biokemijskih pretraga krvi

Iva Šmit, D. Potočnjak*, Vesna Matijatko, Ines Jović, F. Kajin, Mirna Brkljačić i R. Beck

---

Dr. sc. Iva ŠMIT, dr. med. vet., viša asistentica, dr. sc. Dalibor POTOČNJAK*, dr. med. vet., redoviti profesor, (dopisni autor, e-mail: dpotocnjak@vef.hr), dr. sc. Vesna MATIJATKO, dr. med. vet., redovita profesorica, Ines JOVIĆ, dr. med. vet., asistentica, Filip KAJIN, dr. med. vet., stručni suradnik, dr. sc. Mirna BRKLJAČIĆ, dr. med. vet., docentica, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska; dr. sc. Relja BECK, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

▲

Uvod

---

U kliničkoj praksi s domaćim mesožderima, poglavito psima, veterinari su često suočeni sa zdravstvenim problemima kao što su kronični, intermitentni, odnosno povratni probavni poremećaji.
Najčešći probavni simptomi koji se javljaju u pasa su povraćanje i proljev, a njihovi uzroci mogu biti mnogobrojni. Najčešći uzroci koji dovode do disfunkcije gastrointestinalnog trakta, odnosno manifestacije probavnih simptoma u pasa su invazije parazitima, infekcije bakterijama ili virusima, idiopatska upala (upalna bolest crijeva), intoksikacije različitog karaktera i pogreške pri hranjenju.Tijekom provođenja dijagnostičkog protokola treba isključiti sekundarne uzroke, poput bolesti jetre, bubrega, gušterače i endokrinopatije, koji u kliničkoj slici manifestiraju iste probavne smetnje (Tams, 2003.).

Klinička slika bolesti probavnog trakta i njezin intenzitet razlikuju se od pacijenta do pacijenta, što ovisi o etiološkim čimbenicima bolesti, individualnoj dispoziciji, lokalizaciji i intenzitetu promjena u probavnom traktu (Gaschen, 2010., Šmit i sur., 2017.).

Giardijoza predstavlja parazitnu bolest ljudi i brojnih vrsta domaćih, ali i divljih životinja prouzročena bičašima iz roda Giardia. Česti je parazit probavnog trakta životinja uključujući i pse i mačke. Prijenos je najčešće ingestijom kontaminirane vode i hrane, a u nekim sredinama posjeduje i određeni zoonotski potencijal. Znanstvenim je istraživanjima utvrđeno da bičaš G. duodenalis nije genetski jedinstven. Sastoji se od 8 genetskih tipova, od kojih su neki vrsno specifični, a drugi su invazivni za različite vrste životinja i ljude. Psi mogu biti invadirani s 4 genska tipa od koja su dva potencijalno zoonotski (Beck i sur., 2011., Beck i sur., 2012.).

G. duodenalis najčešći je crijevni parazit u ljudi, a prouzroči kliničku sliku koja se očituje akutnim ili kroničnim proljevom, mučninom, abdominalnim bolovima, dehidracijom, nadmom i gubitkom tjelesne težine (Farthing, 1997., Eckmann, 2003.).

Invazije G. duodenalis u pasa su vrlo česte, a klinička slika može varirati od blage do izrazite. Određen broj pasa invadiran s G. duodenalis je bez ikakvih kliničkih simptoma (Tangtrongsup i Scorsa, 2010.).

Najčešći probavni simptom je vrlo učestali i tvrdokorni proljev koji varira od mekše formirane stolice pa sve do potpuno profuznog i vodenastog proljeva, a može biti akutnog ili kroničnog tijeka. U stolici može biti prisutna sluz, a može se javiti i flatulencija. Ponekad je prisutna steatoreja i vrlo neugodan miris stolice (Hernot i sur. 2005., Šmit i sur., 2016.). Većina pasa je tijekom bolesti afebrilna. U nekih životinja zabilježena je i malabsorpcija s gubitkom tjelesne težine. U imunokompetentnih životinja proljev je često samoograničavajući.
Tijekom palpacije abdomena pasa često se mogu palpirati zadebljani zavoji tankih crijeva. U imunosuprimiranih životinja te u prisutnosti koinfekcija klinička slika giardijoze može biti jačeg intenziteta (Owens i Greenson, 2007., Tangtrongsup i Scorza, 2010., Šmit i sur., 2017.).

Zbog česte pojavnosti Giardia duodenalis i posljedično razvoja probavnih simptoma u pasa vrlo je bitno u sklopu kliničke obrade pacijenta utvrditi utjecaj G. duodenalis na hematološke pokazatelje i biokemijske pokazatelje u krvi, kao segment kompletnog zdravstvenog statusa pacijenta tijekom ove bolesti.

U životinja invadiranih G. duodenalis nalazi hematoloških i biokemijskih pretraga krvi uglavnom su u fiziološkim granicama te u literaturi nisu zabilježena odstupanja koja bi se smatrala patognomoničnima. U pasa s intenzivnim i učestalim proljevom promjene referentnih vrijednosti određenih hematoloških i biokemijskih pokazatelja mogu upućivati na dehidraciju i gubitak elektrolita. Rendgenološkom pretragom abdomena ponekad se može ustvrditi prisutnost veće količine plina ili tekućeg sadržaja u tankim crijevima (Eckmann, 2003., Suchodolski, 2008., Tangtrongsup i Scorza, 2010.).

Najučinkovitiji način prevencije invazije G. duodenalis je sprječavanje ingestije invazivnih cisti onemogućavanjem pasa da piju potencijalno kontaminiranu vodu. Jedna od vrlo važnih i učinkovitih metoda smanjivanja kontaminacije okoliša cistama G. duodenalis je i redovito sakupljanje fecesa pasa nakon defekacije (Smith i sur., 2014.).

▲

Materijali i metode

---

U istraživanje su bila uključena 82 psa uvedena u ambulantni protokol (Inc. Veterina) koji su zaprimljeni u Kliniku za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta u Zagrebu zbog probavnih simptoma (n=42) kao i psi koji su obrađivani u svrhu sistematskih pregleda (n=40), a nisu imali probavne simptome, odnosno, samo psi za koje su u ambulantnom protokolu postojali podatci o laboratorijskim pretragama krvi te pretragama stolice.
Istraživanjem su obuhvaćeni psi neovisno o spolu i pasmini, stariji od godinu dana te samo psi koji su redovito cijepljeni protiv parvovirusne infekcije pasa i koronavirusne infekcije pasa. Uzorci stolice pasa prikupljeni su neposredno nakon defekacije u sterilne posudice zapremine 50 mL te su unutar 8 sati dostavljeni u parazitološki laboratorij Veterinarskog instituta na parazitološku obradu. Svi uzorci pretraženi su na postojanje parazita metodom flotacije te neposrednom imunoflourescencijom, a tipizacija svih giardija provedena je izdvajanjem ukupne DNK, umnažanjem specifičnog odsječka DNK i određivanjem nukleotidnog sljeda pročišćenog proizvoda za svaki pojedini izolat.

Psi su podijeljeni na dvije skupine: pse pozitivne na G. duodenalis i pse negativne na G. duodenalis. Unutar skupine pozitivnih na G. duodenalis formirane su skupine pasa ovisno o pojedinom genskom tipu G. duodenalis.

Psi uključeni u istraživanje bili su klinički pregledani u svrhu isključivanja drugih sistemskih bolesti te su od vlasnika/držatelja uzeti temeljiti anamnestički podatci.

Klinički se pregled sastojao od:

1. mjerenja tjelesne temperature, određivanja frekvencije bila i disanja
2. pregleda vidljivih sluznica i palpacije potkožnih limfnih čvorova
3. auskultacije pluća i srca
4. palpacije abdomena.

Uzimanje i priprema uzoraka krvi

Svim psima uzeta je krv iz venae cephalicae antebrachii u epruvete s kalij-etilen diamino tetraoctenom kiselinom (EDTA) za hematološke pretrage i u epruvete s gelom za biokemijske pretrage.
Krv iz epruvete s gelom ostavljena je 30 min da se zgruša te centrifugirana na 3000 okretaja tijekom 10 min.

Krv iz epruvete s antikoagulansom iskorištena je za dobivanje hematoloških pokazatelja na hematološkom brojaču Backer System Serrano 9120 (Serrono-Backer Diagnostic, Inc, Allentown, Pennsylvania, SAD) i za diferencijalnu krvnu sliku (krvni razmaz bojan standardnim bojanjem May-Grunwald-Giemsa). Diferencijalna krvna slika dobivena je brojenjem udjela segmentiranih i nesegmentiranih granulocita, monocita i limfocita na 100 leukocita u preparatima krvnog razmaza. Rasponi referentnih vrijednosti za pojedine pokazatelje kompletne krvne slike navedeni su u tabeli 1.

Tijekom obrade istraživanjem obuhvaćenih pasa promatrani su sljedeći pokazatelji: ureja, kreatinin, glukoza, alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, ukupni bilirubin, alfa- amilaza, lipaza, ukupni proteini, albumini, kreatin kinaza, kolesterol i trigliceridi koje su sastavni dio biokemijskog profila, kako u dijagnostici bolesti probavnog sustava, tako i pri izvođenju sistematskih pregleda klinički zdravih pasa. Biokemijski pokazatelji određivani su u cilju isključivanja bolesti ostalih organskih sustava koje mogu dovesti do pojave nespecifičnih kliničkih simptoma (npr. zatajivanje bubrega).
Biokemijski pokazatelji određeni su standardnim metodama na biokemijskom analizatoru Olympus AU 600 s kemikalijama tvrtke Olympus (Olympus diagnostica GMBH). Rasponi referentnih vrijednosti za pojedine biokemijske pokazatelje u serumu pasa navedeni su u tabeli 2.

Statistička obrada podataka obavljena je programom Stata 13.1 (Stat Corp. USA). Rezultati su prikazani kao medijan, minimalna i maksimalna vrijednost ili kao aritmetička sredina s pripadajućom standardnom devijacijom, ovisno o razdiobi podataka. Vrijednosti su međusobno uspoređene t-testom ili testom za neparametrijske vrijednosti (Man Whitney U-test).

▲

Rezultati

---

Opažene razlike vrijednosti hematoloških i biokemijskih pokazatelja (srednja vrijednost- SV i standardna devijacija –SD) između pasa invadiranih i neinvadiranih s G. duodenalis nisu statistički značajne (tabela 3).

Opažene su statistički značajne razlike u koncentraciji ureje i aktivnosti ALT, lipaze i CPK (označeno bold) između pasa u kojih su izolirane G. duodenalis i pasa u kojih nisu izolirane G. duodenalis (tabela 4).

Opažene razlike u vrijednostima istraživanih hematoloških pokazatelja krvi između pasa invadiranih genskim C i D skupinama nisu statistički značajne (tabele 5 i 6).

Opažene razlike u vrijednostima istraživanih biokemijskih pokazatelja krvi između pasa invadiranih genskim skupinama C i D nisu statistički značajne (tabela 7).

Utvrđene su statistički značajne razlike u vrijednostima amilaze i kreatinin kinaze (označeno bold) između dviju skupina invadiranih pasa (tabela 8).

▲

Rasprava

---

U dosadašnjim istraživanjima malo se pažnje posvećivalo hematološkim i biokemijskim pokazateljima u pasa invadiranih s G. duodenalis. Opažene razlike vrijednosti hematoloških i većine biokemijskih pokazatelja (tabele 3 i 4) u pasa invadiranih i neinvadiranih s G. duodenalis u ovom istraživanju nisu statistički značajne. Bordeau (1993.) navodi kako je u pasa u kojih je utvrđena invazija G. duodenalis prisutna tendencija nastanka eozinofilije, ali ovim istraživanjem to nije dokazano. Jain (1986.) je ustvrdio da je broj eozinofila u cirkulaciji proporcionalan stupnju antigene stimulacije pa tako i stupnju antigene stimulacije parazita. Iz toga se i iz činjenice da ovim istraživanjem nije utvrđena pojava eozinofilije u pasa invadiranih giardijama može zaključiti da postoji opravdana sumnja kako antigena stimulacija od strane G. duodenalis nije dovoljno intenzivna da bi prouzročila opsežnu eozinofiliju te se eozinofilija ili izostanak iste u svakodnevnoj kliničkoj praksi ne može koristiti kao prediktor invazije s G. duodenalis.

Rosa i sur. (2007.) su proveli istraživanje biokemijskih pokazatelja u pasa invadiranih s G. duodenalis. U navedenom istraživanju nisu utvrđene statistički značajne razlike u koncentraciji ukupnih proteina, albumina, ALT, AST, GGT, ureje i kreatinina u serumu. Ovim istraživanjem utvrđene su statistički značajne razlike u koncentraciji ureje te aktivnosti ALT, lipaze i CPK između pasa u kojih je izolirana G. duodenalis i pasa u kojih nije izolirana G. duodenalis.

Ustvrdili smo statistički značajno nižu aktivnost ALT u pasa invadiranih s G. duodenalis. Međutim, aktivnost ALT nalazi se unutar referentnih vrijednosti i u invadiranih i u neinvadiranih pasa.
Snižena aktivnost ALT nema nikakvo značenje u veterinarskoj medicini (Bush, 1991., Willard i Twedt, 2004.) te se rezultat dobiven ovim istraživanjem ne može interpretirati.

Snižena koncentracija ureje zabilježena je kod zatajenja jetre, portosistemskog shunta, diabetesa insipidusa i psihogene polidipsije, primarne hiperamonijemije, uporabe anaboličkih steroida i hranidbe s niskim udjelom proteina. Međutim, u našem istraživanju je statistički značajno niža koncentracija ureje u pasa invadiranih s giardijama još uvijek unutar referentnih vrijednosti koncentracije ureje za pse, dok se gore navedeni uzroci odnose na koncentraciju ureje ispod referentnih vrijednosti. Sva gore navedena stanja očituju se i ozbiljnim kliničkim simptomima (neurološki simptomi, poliurija, polidipsija, epilepsijski napadi) koji u pasa obuhvaćenim ovim istraživanjem nisu zabilježeni (Bush, 1991., Suchodolski, 2008.). Uzevši u obzir sve navedeno, dobiveni rezultati se ne mogu okarakterizirati patološkim.

U našem istraživanju utvrđene su statistički značajne povišene aktivnosti lipaze i CPK u pasa u kojih je utvrđena G. duodenalis. Aktivnost lipaze bila je statistički značajno viša u pasa invadiranih giardijama u odnosu na neinvadirane pse, ali i u invadiranih i u neinvadiranih pasa aktivnost lipaze bila je povišena u odnosu na referentne vrijednosti. Dio pasa obuhvaćenih ovim istraživanjem imao je proljev. Kako je lipaza enzim koji osim iz gušterače može biti podrijetlom i iz duodenuma (Jacobs, 1989., Steiner i sur., 2006.) nije iznenađujuće da je njezina aktivnost bila povišena u pasa s proljevom.
Statistički značajno viša aktivnost lipaze u pasa s utvrđenim giardijama od aktivnosti lipaze u pasa bez utvrđenih giardija najvjerojatnije su posljedica patoloških procesa koje G. duodenalis prouzroči u duodenumu. Kako bi sa sigurnošću tvrdili da su rezultati ovog istraživanja posljedica patoloških procesa u duodenumu potrebno je u budućim istraživanjima određenim metodama odrediti koncentraciju lipaze podrijetlom isključivo od gušterače te time gušteraču isključiti kao potencijalni uzrok povišenja ovog biokemijskog pokazatelja.

Ovim istraživanjem utvrđene su statistički značajne razlike u aktivnosti CPK u pasa u kojih su izolirane G. duodenalis i pasa u kojih nisu izolirane G. duodenalis. Povišena koncentracija CPK u pasa javlja se kod oštećenja skeletnog mišićja, ekstremnih tjelesnih napora, hipotireoze i bolesti središnjeg živčanog sustava, ali i laboratorijskih grešaka (hemoliza, povišena koncentracija bilirubina) (Bush, 1991.). Međutim, gore navedene bolesti očituju se povišenjem aktivnosti CPK iznad referentnih vrijednosti što u našem istraživanju nije slučaj. Ipak, u istraživanjima koja su se osvrtala na patogenetske mehanizme giardijoze navodi se i eventualna produkcija toksina te oštećenje ne samo epitela već i dubljih slojeva sluznice crijeva (Tangtrongsup i Scorza, 2010.).
Graeber i sur. (1984.) navode oštećenje seromuskularnog sloja tankih crijeva kao uzrok povišenja aktivnosti CPK u serumu. Keller (1981.) kao tkiva s najintenzivnijom aktivnosti CPK navodi skeletnu muskulaturu, ali i srčanu muskulaturu, dijafragmu, glatku muskulaturu probavnog sustava te mozak. Uzevši u obzir sve navedeno moglo bi se zaključiti da je statistički značajno viša aktivnost CPK posljedica mikrooštećenja koje G. duodenalis prouzroči prihvaćanjem trofozoita za epitel tankih crijeva.

Vrijednosti hematoloških pokazatelja i većine biokemijskih pokazatelja u pasa invadiranih genskim C i D skupinama nisu statistički značajne (tabele 5, 6, 7 i 8). Ovim istraživanjem utvrđena je statistički značajno viša aktivnost amilaze u pasa invadiranih giardijama genske skupine C te statistički značajno viša aktivnost CPK u pasa invadiranih s giardijama genske skupine D (tabela 8).
Aktivnost amilaze je u i pasa invadiranih s giardijama genske skupine C i u pasa invadiranih giardijama genske skupine D u granicama referentnih vrijednosti dok je aktivnost CPK u pasa invadiranih s giardijama genske skupine D blago iznad referentnih vrijednosti. Kako je određivanje aktivnosti CPK jedna od najosjetljvijih laboratorijskih pretraga i vrlo često njena aktivnost može biti lažno pozitivna zbog laboratorijskih grešaka ili minimalno invazivnih zahvata (vađenje krvi, injekcije) preporuka je kod povišenih vrijednosti ponavljati pretragu te se tek perzistentno povišena aktivnost CPK smije interpretirati. Kako se u našem istraživanju radi o minimalnom povišenju aktivnosti CPK u pasa invadiranih giardijama genske skupine D (3%) ovaj rezultat s oprezom treba interperetirati.
Interpretacija ovih rezultata bez dodatnih istraživanja u ovom trenutku bila bi nepouzdana.

Uzevši u obzir sve rezultate dobivene ovim istraživanjem može se zaključiti da bi u pasa u okviru gastroenterološke obrade i/ili sistematskog pregleda obvezno trebalo provesti i pretragu na giardije, ali i ostale parazite/patogene. Rezultati našeg istraživanja demantiraju neka uvriježena mišljenja u svakodnevnoj kliničkoj praksi u Hrvatskoj kao što je obvezno prisutstvo eozinofilije u parazitarnih invazija pa izostanak eozinofilije ne smije biti argument za isključivanje parazitarnih invazija, osobito invazije s G. duodenalis.

▲

Sažetak

---

U kliničkoj praksi s domaćim mesožderima, poglavito psima, veterinari su često suočeni sa zdravstvenim problemima kao što su kronični, intermitentni, odnosno povratni probavni poremećaji. Najčešći uzroci koji dovode do manifestacije probavnih simptoma u pasa su invazije parazitima, infekcije bakterijama ili virusima, idiopatska upala (upalna bolest crijeva), intoksikacije i pogreške pri hranjenju.
U ovo istraživanje su bila uključena 82 psa koji su zaprimljeni u Kliniku za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu zbog probavnih simptoma kao i psi koji su klinički obrađivani u svrhu sistematskih pregleda, a nisu imali probavne simptome.
Istraživanjem su obuhvaćeni psi neovisno o spolu i pasmini, stariji od godinu dana te samo psi koji su redovito cijepljeni protiv parvovirusne infekcije pasa i koronavirusne infekcije pasa. Uzorci stolice pasa pretraženi su na postojanje parazita metodom flotacije te neposrednom imunoflourescencijom, a tipizacija svih giardija provedena je izdvajanjem ukupne DNK, umnažanjem specifičnog odsječka DNK i određivanjem nukleotidnog slijeda pročišćenog proizvoda za svaki pojedini izolat. Svim psima uzeta je krv iz venae cephalicae antebrachii za hematološke pretrage i biokemijske pretrage.
Opažene razlike vrijednosti hematoloških i većine biokemijskih pokazatelja u pasa invadiranih i neinvadiranih s G. duodenalis u ovom istraživanju nisu statistički značajne.
Ovim istraživanjem utvrđene su statistički značajne razlike u koncentraciji ureje te aktivnosti ALT, lipaze i CPK između pasa u kojih je izolirana G. duodenalis i pasa u kojih nije izolirana G. duodenalis. Vrijednosti hematoloških pokazatelja i većine biokemijskih pokazatelja u pasa invadiranih genskim C i D skupinama nisu statistički značajne. Ovim istraživanjem utvrđena je statistički značajno viša aktivnost amilaze u pasa invadiranih giardijama genske skupine C te statistički značajno viša aktivnost CPK u pasa invadiranih s giardijama genske skupine D. Rezultati našeg istraživanja demantiraju neka uvriježena mišljenja u svakodnevnoj kliničkoj praksi u Hrvatskoj kao što je obvezno prisutstvo eozinofilije u parazitarnih invazija pa izostanak eozinofilije ne smije biti argument za isključivanje parazitarnih invazija, osobito invazije s G. duodenalis.
Ključne riječi: G. duodenalis, pas, hematološki i biokemijski pokazatelji

Literatura [… prikaži]

▲

Impact of Giardia duodenalis infection on haematological and biochemical parameters in dogs

---

Iva ŠMIT, DVM, PhD, Senior Assistant, Dalibor POTOČNJAK, DVM, PhD, Full Professor, Vesna MATIJATKO, DVM, PhD, Full Professor, Ines JOVIĆ, DVM, Assistant, Filip KAJIN, DVM, Expert Associate, Mirna BRKLJAČIĆ, DVM, PhD, Assistant Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia; Relja BECK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia

---

In small animal practice, chronic digestive disorders are the most commonly reported disorders. The most common chronic digestive symptom is diarrhoea, which may be caused by a large number of digestive disorders (bacterial, viral, fungal or protozoan infection), inflammatory bowel disease, intoxication, or can be food induced. In this study, we retrospectively collected data from 82 dogs of both sexes, regardless of breed, older than one year and fully vaccinated, that were presented to the Clinic for Internal Diseases of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb.
Dogs were presented to the clinic for a variety of reasons, including gastrointestinal symptoms, routine examination or general health examination. Diagnostic tests were performed, including CBC and serum biochemical analysis, to exclude underlying disorders and to evaluate potential changes in laboratory findings. All faecal samples were examined for intestinal parasites by direct microscopic examination after the flotation technique and by immunofluorescence, and giardia positive samples were subjected to further genetic characterization by using PCR of small subunit ribosomal DNA (Ssu rRNA gene) genes. Blood was collected from the venae cephalicae antebrachii for haematology and biochemistry analysis as a part of the routine examination. Haematology results and most biochemistry results showed no statistically significant differences between dogs with or without G. duodenalis infections.Statistically significant differences were found in Giardia positive dogs for the concentrations of BUN and activity of lipase, CPK and ALT. Haematology results and most biochemistry results showed no statistically significant differences between dogs infected with different strains of G. duodenalis (C or D). A statistically significant increase in amylase activity was found in dogs infected with G. duodenalis assemblage C and a statistically significant decrease in CPK activity was found in dogs infected with G. duodenalis assemblage D.
The results of this study contradict some of traditionally accepted “knowledge” in small animal practice in Croatia, such as the expectation of eosinophilia in dogs infected with gastrointestinal parasites. A lack of eosinophilia should not be an argument for exclusion of parasite invasions in dogs, especially G. duodenalis invasion.
Key words: G. duodenalis, dog, hematological and biochemical parameters