B. Pirkić, D. Capak, D. Kezić, Mirna Tominac Trcin, Njetočka Gredelj Šimec, H. Borošak, Mirna Abaffy, Lea Slunjski, G. Mršić, D. Špoljarić, D. Mihelić i Maja Popović
Dr. sc. Boris PIRKIĆ, dr. med. vet., izvanredni profesor, dr. sc. Darko CAPAK, dr. med. vet., redoviti profesor, dr. sc. Dubravko KEZIĆ, dr. med. vet., viši asistent – znanstveni novak, Mirna ABAFFY, dr. med. vet., stručna suradnica, Daniel ŠPOLJARIĆ, dr. med. vet., asistent-znanstveni novak, dr. sc. Damir MIHELIĆ, dr. med. vet., redoviti profesor, dr. sc. Maja POPOVIĆ, dr. med. vet., redovita profesorica, Veterinarski fakultet, Zagreb; dr. sc. Mirna TOMINAC TRCIN, dr. med., Klinika za traumatologiju KBC “Sestre milosrdnice” Zagreb; dr. sc. Njetočka GREDELJ ŠIMEC, dr. med., Klinička bolnica Merkur, Zagreb; Hrvoje BOROŠAK, dr. med. vet.; Lea SLUNJSKI, dr. med. vet.; dr. sc. Gordan MRŠIĆ, dipl. ing., docent, Centar za forenzična ispitivanja istraživanja i vještačenja Ivan Vučetić”, Zagreb
Uvod
T kivno inženjerstvo je relativno novo multidisciplinarno područje koje povezuje spoznaje i dostignuća tehničkih i prirodnih znanosti, a u medicini ima za cilj u potpunosti obnoviti građu i funkciju tkiva/organa nakon različitih patoloških procesa (Tominac Trcin, 2012.). Danas se primjenom različitih tipova nosača i uz dodatak odgovarajućih biomolekula nastoje uzgojiti regenerativni biološki materijali (tkivni ekvivalenti) poput kože, kosti i hrskavice. No, trenutno još uvijek ne postoji podudaran uzgojeni tkivni biomaterijal koji bi u potpunosti mogao odgovarati anatomiji, fiziologiji i biološkoj stabilnosti zdravog tkiva. Prilikom uzgoja bioloških materijala nužno je poznavanje svojstva materijala koji će poslužiti kao nosač za što bolje prihvaćanje i rast stanice. Svakako, kvalitetan tkivni materijal morao bi imati neke osnovne osobitosti koje uključuju: netoksičnost, minimalnu imunogeničnost, sterilnost, odgovarajuća mehanička, fizikalna i degradacijska svojstva, lagano rukovanje i primjenu. Nadalje, trebao bi osigurati hidrataciju obrađenog defekta, omogućiti angiogenezu i formiranje vitalne prepreke prema okolini te smanjiti bol.U veterinarskoj je medicini vrlo važna i je ekonomski prihvatljiva cijena takvih staničnih/tkivnih presadaka (Popović i sur., 2012.). U Republici Hrvatskoj su prva iskustva in vitro uzgoja staničnih/tkivnih presadaka vezana uz životinjske modele.
Naime, Kezić (2012.a) opisuje da su Jakić-Razumović i sur. još 1994. godine uzgojili in vitro prve keratinocite podrijetlom iz kože psa koji su im potom poslužili kao model uzgoja organotipične kulture kože psa. Novija istraživanja u okviru humane i veterinarske medicine usmjerena su na određivanje odgovarajućeg nosača za u in vitro dobivanje staničnih/tkivnih presadaka. Shodno tome, u kirurgiji rožnice oka sve češće se rabe uzgojene matične stanice limbusa.
Stanična terapija rožnice
Međutim, u veterinarskoj medicini primjena limbalnih epitelnih stanica u kirurgiji rožnice oka pri zahvatima kao što su: transplantacija rožnice ili terapija konjunktivalizacije rožnice te limbalne insuficijencije i keratopatije u životinja vrlo je rijetka (Gredelj-Šimec, 2010.).
Potencijalna bi se opravdanost njihove primjene u veterinarskoj oftalmologiji svakako mogla odnositi na kućne ljubimce te na visokoselekcionirane i visokovrijedne vrste domaćih životinja.
Shodno tome, od godine 2009. na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu provode se klinička istraživanja stanične terapije ozljeda rožnica životinja primjenom in vitro uzgojenih staničnih/tkivnih auto-/alopresadaka limbusa. Naime, u Laboratoriju za stanični uzgoj Zavoda za biologiju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, uzgojeni stanični/tkivni auto/alopresadtci limbalnih stanica, ovisno o vrstama životinja od interesa veterinarske medicine, na Klinici za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu rabe se pri terapiji cijeljenja ozljeda rožnica.
U Laboratoriju se iz prikupljenog tkiva limbusa „in explant“ metodom prikupljaju limbalne nediferencirane/diferencirane stanice (slika 2.).
Potom se, in vitro prikupljene limbalne nediferencirane/diferencirane stanice umnažaju u homogenoj ili heterogenoj kulturi (na hranjivom sloju 3T3 mišjih fibroblasti) (slika 3.a,b) ili na odgovarajućem nosaču poput kontaktne leće ili fibrinskog ljepila (slika 4.a,b).
Stanicama prilikom uzgoja u primarnim/sekundarnim kulturama, odnosno na nosačima u okviru kontrole kvalitete određivani su sljedeći parametri: vijabilnost stanica (MTT-test), morfologija (bojanje May-Grunwald-Giemsa metodom), stupanj diferencijacije i stratifikacije (komercijalna specifična protutijela na citokeratin 3, 19, 21 i p63). Procjena u kojoj mjeri na nosačima uzgojeni tkivni ekvivalenti nalikuju zdravom tkivu limbusu određivani su histološkim i imunohistološkim metodama.
Sva dosadašnja provedena klinička istraživanja stanične terapije na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu imala su suglasnost za provođenje od strane Povjerenstva za dobrobit životinja i Etičkog povjerenstva Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu te Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja (članak 25. Zakona o zaštiti životinja). Vlasnici životinja uključenih u ova istraživanja potpisali su suglasnost za provođenje navedenog zahvata na životinjama u njihovom vlasništvu. Pri izvođenju pokusa sa životinjama postupalo se prema Zakonu o zaštiti životinja i u skladu s preporukama Europske unije (86/609/EEC). Sve životinje, neovisno o vrsti, pasmini, dobi i spolu, uključene u istraživanja bile su pacijenti Klinike za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, s dijagnosticiranim opsežnim, kroničnim stanjenjem središnjeg dijela rožnice (vertex corneae) nastalog uslijed mehaničkog oštećenja te kompliciranom panoznom upalom rožnice oka. Nakon što su se u tih pacijenata isprobale sve dostupne metode liječenja, a bez vidnog poboljšanja, oftalmolog Klinike za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju Fakulteta je ovisno o patologiji rožnice, aplicirao u Zavodu za biologiju Veterinarskog fakultet uzgojene limbalne stanične/tkivne alo-/autopresadtke. Svim pacijentima prije kirurškog zahvata te 3., 10., i 30. dana nakon kiruškog zahvata uzimali su se uzorci periferne krvi za hematološke, biokemijske i citometrijske (CD45+, CD4+, CD8+) analize. Stanični alo-/ autopresadtci, pripremljeni u mediju bez telećeg seruma ili u serumu pacijenta, životinjama su se jednokratno lokalno aplicirali u regiji očne jabučice (slika 5.a). Tkivni alo/autopresadtci limbalnih stanica pripremljeni na kontaktnoj leći ili na fibrinskom gelu životinjama su se aplicirali klasičnim oftalmološkim zahvatom (slika 5.a,b,c).
Pacijenti su se nakon kirurškog zahvata otpuštali na kućnu njegu. Trećeg (3.), desetog (10.) i tridesetog (30.) dana nakon učinjenog zahvata obavljani su kontrolni pregledi na Klinici za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi praćenja zdravstvenog statusa i oftalmološkog pregleda obrađenog oka, odnosno rožnice te procjene uspješnosti primijenjenje stanične terapije. Tako je po prvi put u okviru veterinarske oftalmologije na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu obradom ozljeda rožnica pasa, jednokratnom aplikacijom staničnog/tkivnog auto/alopresadka limbalnih stanica pokazana opravdanost, ali i uspješnost njihove kliničke primjene (Popović i sur., 2009.a,b, Pirkić i sur., 2010., Vlahović i sur., 2010., Kezić i sur., 2012.b).
Naime, ovisno o patologiji rožnice, za u prosjeku već 10. dana nakon primjene stanične terepije u tretiranih pasa bleferospazam je za 80% slabije izražen, za 75% je prisutna manja količina iscjetka, za 43% je slabije izražena konjuktivalna kongestija, za 31% slabiji je edem rožnice, za 55% slabiji je intenzitet iritacije očnog kuta te nisu vidljivi znaci zamućenja očne vodice (slike 6., 7., 8., 9.) pri čemu hematološke, biokemijske i citometrijske analize obrađenih životinja nisu pokazale da primijenjeni stanični alopresadci utječu na promijenu njihovih fizioloških vrijednosti (Šimec-Gredelj, 2010.).
Optimizacijom in vitro uzgoja staničnog/tkivnog auto/alopresadka limbalnih stanica te njihove terapeutske mogućnosti, poticaj su za osnivanje očne banke prema vrstama životinja od interesa za veterinarsku medicinu te osuvremenjivanje i opremanje postojeće oftalmološke kirurške dvorane i postojećeg staničnog laboratorija u čistu prostoriju klase C ili D (standardi dobre proizvodne prakse, eng. GMP) na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu.
Sažetak
Literatura [… prikaži]
Stem cell ophthalmological clinical trials at the Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb
Boris PIRKIĆ, DVM, PhD, Associate Professor, Darko CAPAK, DVM, PhD, Full Professor, Dubravko KEZIĆ, DVM, PhD, Senior Assistant – Junior Researcher, Mirna ABAFFY, DVM, Expert Associate, Daniel ŠPOLJARIĆ, DVM, Assistant – Junior Researcher, Damir MIHELIĆ, DVM, PhD, Full Professor, Maja POPOVIĆ, DVM, PhD, Full Professor, Faculty of Veterinary Medicine, Zagreb; Mirna TOMINAC TRCIN, MD, PhD, Clinic for traumatology, Clinical Hospital Sister of Mercy, Zagreb; Njetočka GREDELJ ŠIMEC, MD, PhD, University Hospital Merkur, Zagreb; Hrvoje BOROŠAK, DVM; Lea SLUNJSKI, DVM; Gordan MRŠIĆ, BSc, PhD, Assistant Professor, Forensic Science Centre “Ivan Vučetić”, General Police Directorate, Ministry of Interior, Zagreb
T issue engineering is a relatively new multidisciplinary field that brings together the understandings and achievements of the technical and life sciences. In medicine, it has the aim of fully altering the form and function of tissues/organs after various pathological processes. The successful optimization of in vitro cultures of auto/allograft limbal stem cells and their therapeutic abilities serves as great incentive to establish an eye bank, in line with the animal species that are of interest to veterinary medicine. This also gives incentive to upgrade and modernize the ophthalmological surgery room and existing laboratory for cell cultures to clean rooms of Grade C or D (Standards of good ophthalmological practice, GMP) at the Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb.
