Application of proteomics in research of parasitic diseases of wildlife
Mandek, S., M. Bujanić, J. Kuleš, F. Martinković, M. Sindičić, D. Konjević*
Siniša MANDEK, dr. med. vet., Ministarstvo poljoprivrede, dr. sc. Miljenko BUJANIĆ, stručni suradnik, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, dr. sc. Josipa KULEŠ, poslijedoktorandica, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, dr. sc. Franjo MARTINKOVIĆ, docent, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, dr. sc. Magda SINDIČIĆ, izvanredna profesorica, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, dr. sc. Dean KONJEVIĆ, izvanredni profesor, Dipl. ECZM, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu. *Dopisni autor: konjevic@vef.hr
SažetakAbstractUvodMorfološka dijagnostika parazitaDruge metodePrimjena proteomike u istraživanju invazijskih bolesti divljih životinjaZaključakZahvalaLiteratura
Sažetak
T očna identifikacija parazitskih vrsta i dijagnostika invazijskih bolesti temelj je znanstvenog razvrstavanja, ali i liječenja pojedinih bolesti. Identifikacija temeljena na morfološkim značajkama parazita i nadalje je osnova dijagnostičkih metoda. Iako je ova metoda vrlo pouzdana, razvoj molekularnih metoda pruža nove mogućnosti za kombiniranje više metoda radi točnije dijagnostike i izbjegavanja mogućih poteškoća uvjetovanih razlikama u uzorkovanju te pripremi i pohrani parazita, uvjetima u kojima je lešina boravila do dopreme na analizu i sl. Osim u navedenim slučajevima, kombinacija metoda također se posebno preporučuje u slučaju visoke srodnosti parazita. Osim toga uvođenje proteomike otvara nove mogućnosti u istraživanju parazita divljih životinja s posebnim naglaskom na potencijalnu primjenu u liječenju, razvoju mjera kontrole i dizajnu cjepiva.
Ključne riječi: divlje životinje, paraziti, identifikacija vrsta, proteomika.
Abstract
Accurate identification of parasitic species and disease diagnostics is a prerequisite for species systematics and treatment of potential diseases. Diagnosis based on analysis of morphological keys is still a fundamental method in parasitology. Despite its reliability, development of molecular methods offers new possibilities in combining these methods with the aim of more accurate diagnostics and avoidance of potential problems caused by variations in sampling and parasite preparation/fixation, the conditions in which carcasses were stored before analysis, etc. Apart from these cases, method combination is highly recommendable in closely related species. Additionally, introduction of proteomics in this field opens new areas in the research of wildlife parasitic diseases, with special emphasis on potential applications in treatment, development of disease control strategies, and vaccine design.
Key words: wildlife, parasites, species identification, proteomics.
Uvod
Kad govorimo o parazitima divljih životinja, svakako je nužno ponovno napomenuti dvije činjenice, prvu da su paraziti redovit nalaz u divljih životinja i drugu da je gospodarenje divljim životinjama u Republici Hrvatskoj uglavnom u tipu prirodnog uzgoja.
Tomu valja dodati i nepostojanje sustavnog praćenja na razini države. Te su činjenice iznimno važne za praćenje bolesti u divljih životinja. Naime u ovakvim uvjetima prikupljanje uzoraka/lešina divljih životinja ovisi primarno o individualnom angažmanu ovlaštenika prava lova i lovcima te manjim dijelom o znanstvenim istraživanjima. To nam govori da će većina parazitskih invazija koje ne uzrokuju klinički vidljivu bolest ili pak gubitke na mladunčadi ili trofejnoj vrijednosti u pravilu proći nezapaženo. Bez sustavnog prikupljanja uzoraka i dijagnostike, gubimo vrijedne spoznaje o prisutnosti i učestalosti pojedinih vrsta parazita, kao i o svim daljnjim znanstveno utemeljenim procjenama učinka na određene vrste divljih životinja ili pak moguću procjenu dotičnu vrstu, ili pak moguću procjeni rizika za zdravlje domaćih životinja i ljudi. Jedan od primjera kasne dijagnostike vrlo je vjerojatno i pojava velikog američkog metilja (Fascioloides magna) u Republici Hrvatskoj. Njega su po prvi put na području Šeprešhata u Baranji identificirali Marinculić i suradnici (2002.), na primjercima izdvojenima iz jetre jelena običnog tijekom 2000. godine. Uvažavajući činjenicu da F. magna kao alohtona vrsta dolaskom u novo područje u pravilu ne doseže punu veličinu od 10 cm, nego je znatno manji, lako je moguće da su prve invazije ostale nezabilježene, posebice ako je poznato da se iznutrice naše divljači u većini slučajeva neškodljivo uklanjaju putem jama za zakapanje ili kafilerije. U prilog ovakvim pojavama različitih veličina parazita u novom nositelju u odnosu na izvornog pregledno je prikazao Haley (1962.).
Osim spomenutih problema tijekom prikupljanja uzoraka dodatnu otežavajuću okolnost u dijagnostici parazitskih bolesti divljih životinja čini i stupanj raspadanja u kojem se lešine dostavljaju na analizu, što je posljedica izloženosti vremenskim uvjetima i uglavnom kasnog pronalaska. U konačnici, kašnjenje u dijagnostici za sobom povlači i kašnjenje u eventualnim mjerama kontrole.
U ovom stručnom radu cilj nam je osvrnuti se na tradicionalne i novije metode parazitološke dijagnostike, s posebnim naglaskom na primjenu proteomike u istraživanju invazijskih stanja divljih životinja.
Morfološka dijagnostika parazita
Već smo naveli da kod pojedinih vrsta, a posebice kad je riječ o novoformiranim žarištima, može doći do variranja u veličini parazita. Potvrdu za to daje i istraživanje Bruce i suradnika (1961.) koji su ustanovili razlike u veličini parazita Schistosoma mansoni prilikom invazije 13 različitih vrsta sisavaca. Drugi problemi uključuju i reduciranje tjelesnih značajki, pri čemu pojedini paraziti postaju praktično samo rasplodni organi. Takvo pojednostavljenje građe i oblika može biti problem zbog nedostatnih pokazatelja nužnih za filogenetsku analizu (Evans i sur., 2010.; Perkins i sur., 2011.). Sve to postavlja izazov pred dijagnostičara ponajprije u smislu određivanja u kojoj mjeri odstupanja van postavljenih granica i dalje predstavljaju određenu vrstu (Perkins i sur., 2011.). I bez navedenih otegotnih okolnosti pojedine vrste unutar istog roda mogu imati gotovo identične morfološke značajke. Primjer za to jesu paraziti roda Setaria, gdje sličnost može dovesti do otežane identifikacije i potrebe za primjenom dodatnih analiza (Yatawara i sur., 2007.; Ferri i sur., 2009.; Laaksonen i sur., 2009.; Čurlík i sur., 2019.). To je uzrok naknadnih brojnih rasprava i različitih tumačenja. Unatoč tomu, morfološka dijagnostika i dalje ima brojne prednosti u parazitologiji, poput razlikovanja istodobne invazije s dvije ili više vrsta međusobno srodnih parazita (Kafle i sur., 2015.). Zaključno možemo istaknuti da je morfološka dijagnostika i dalje važan dio identifikacije parazita, a da je njezino upotpunjavanje drugim tehnikama zasigurno smjer u kojem bi današnja dijagnostika trebala ići. Ako se primjenjuje isključivo morfološka dijagnostika, nužna je kvalitetna fotodokumentacija kako bi se u eventualnim naknadnim istraživanjima mogla provjeriti postavljena dijagnoza. S takvim problemom, tj. nemogućnošću usporedbe fotodokumentacije, susreli su se Čurlík i suradnici (2019.) u identifikaciji parazita Setaria tundra u srne obične tijekom usporedbe s prijašnjim nalazom u iste životinjske vrste s drugom, sličnom vrstom parazita, Setaria labiatopapillosa (Richter, 1959).
Druge metode
Primjena molekularnih metoda u parazitologiji u znatnom je porastu u novije vrijeme. Trenutačno ove metode uključuju analizu definiranih markera (dijelova DNA) pomoću lančane reakcije polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) i njezinih inačica (RAPD, AFLP, RFLP, LAMP i RT-PCR). Razvojem molekularnih metoda došlo je i do porasta njihove osjetljivosti i specifičnosti te je postalo moguće identificirati i parazite koji su međusobno vrlo slični.
Osim toga molekularne se metode dobrim dijelom provode rutinski (Kumar i sur., 2021.). Ovakav razvoj događaja utjecao je i na razvoj sistematike i epidemiologije parazita, razumijevanja odnosa nositelja i parazita, razumijevanje razvoja imunosti, kao i razvoja cjepiva (Kumar i sur., 2021.). Primjenom molekularnih moguće je pratiti i srodnost pojedinih linija parazita unutar iste vrste. Tako u literaturi ima više radova koji se koriste analizom mitohondrijske DNA (gen cox-1, gen nad-1) metilja F. magna za razlikovanje pojedinih haplotipova (ovisnih o žarištima), ali i za razlikovanje od velikog metilja Fasciola hepatica (Králová-Hromadová i sur., 2008.; Bazsalovicsová i sur., 2013.; Husch, 2016.; Husch i sur., 2017.). Konačno, izrađena je i potpuna analiza mitohondrijskoga genoma metilja F. magna kao i usporedba 12 gena s 20 vrsta drugih, metilja iz 11 porodica (Ma i sur., 2016.).
Važno je napomenuti da u primjeni navedenih metoda treba voditi brigu o potencijalnim onečišćenjima tijekom pripreme uzoraka što može dovesti do pogrešnih rezultata. Prepreka su i uvjeti skladištenja koji mogu degradirati uzorke i onemogućiti izolaciju odgovarajućih molekularnih markera.
Primjena proteomike u istraživanju invazijskih bolesti divljih životinja
Jedan od primjera primjene proteomike u proučavanju invazijskih bolesti divljih životinja s više važnih znanstvenih doprinosa jest istraživanje odnosa nositelja i parazita u slučaju invazije divovske žabe (Rhinella marina) oblićem Ortleppascaris sp. (Silva i sur., 2014.). Pritom je, među ostalim, otkriven i As37, imunoreaktivni antigen s potencijalom u izradi cjepiva protiv ove bolesti. Također su utvrđeni proteini lon-3 i PP2C, koji s obzirom na visoku evolucijsku očuvanost upućuju na potencijal u strukturnim istraživanjima razvoja i diferencijacije spola oblića. Swan i suradnici (2019.) na primjeru metilja Fasciola hepatica otkrili su čitav spektar glikoproteina koji imaju ključnu ulogu u odnosu nositelja i parazita, pa se čak govori o potencijalnoj ulozi u dizajniranju cjepiva. Cantacessi i suradnici (2012.) analizirali su transkriptom i ekskretorni i sekretorni proteom spolno zrelih metilja Fascioloides magna.
Utvrdili su 835 proteina, od kojih je njih 80 prepoznato kao ekskretorni i sekretorni produkti ovoga metilja. Među najzastupljenijima bili su antioksidacijski proteini, peptidaze i proteini uključeni u metabolizam ugljikohidrata. Autori ovog istraživanja smatraju da je dobivena baza podataka temelj budućih istraživanja molekula koje imaju ulogu u odnosu nositelja i parazita, a koje potencijalno mogu poslužiti i za kreiranje novih strategija liječenja fascioloidoze. Usporedna analiza proteoma seruma i jetre divljih svinja invadiranih metiljem F. magna pokazala je promjene proteoma nositelja na lokalnoj i općoj razini, identificirajući proteine povezane s imunosnim odgovorom nositelja, oksidacijskim stresom i metaboličkim promjenama (Kuleš i sur., 2021.). Dobiveni rezultati temelj su za daljnje istraživanje učinkovitije kontrole i novih metoda liječenja fascioloidoze.
Zaključak
Posebno treba naglasiti sve očitiju primjenu proteomike u ovom području, kao i postojanje dodatnih vrijednosti koje ona pruža. Za pretpostaviti je da će i proteomika, kao uostalom i molekularne metode, s vremenom postati jeftinija, a time i dostupnija za češću upotrebu u parazitološkoj dijagnostici.
Zahvala
Literatura [… prikaži]
Vezano (proteomika):
- Na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu obranjen prvi dvojni doktorat
- Dr. sc. Vladimiru Farkašu dodijeljen projekt za istraživanje Alzheimerove bolesti
- Nova generacija sekvenciranja u veterinarskoj medicini – pregled II. dio
- Nova generacija sekvenciranja u veterinarskoj medicini – pregled I. dio
- Ocjena ejakulata: može li se procijeniti plodnost?