Ž. Cvetnić, Sanja Duvnjak, Maja Zdelar-Tuk, Irena Reil, B. Habrun, M. Benić, R. Beck, G. Kompes, Maja Stepanić i S. Špičić
Dr. sc. Željko CVETNIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni redoviti profesor, dr. sc. Sanja DUVNJAK, dipl. ing., znanstvena novakinja, dr. sc. Maja ZDELAR-TUK, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, Irena REIL, dr. med. vet., stručna suradnica, dr. sc. Boris HABRUN, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni izvanredni profesor, dr. sc. Miroslav BENIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni docent, dr. sc. Relja BECK, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, dr. sc. Gordan KOMPES, dr. med. vet., viši znanstveni suradnik, Maja STEPANIĆ, dr. med. vet., stručna suradnica, dr. sc. Silvio ŠPIČIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut Zagreb
Uvod
Z a razumijevanje nomenklature, taksonomije, opće strukture i molekularne raznolikosti roda Brucella (B.), preduvjet je poznavanje njezinog nastanka i povijesti. Rod Brucella pripada razredu Alpha-Proteobacteria, redu Rhizobiales, porodici Brucellaceae. Rod su prvi opisali Meyer i Shaw 1920. godine u kojem je opisana tipična vrsta Brucella melitensis koja je inficirala ljude i koze, dok je druga po redu B. abortus inficirala goveda i u njih izazivala pobačaje. U istraživanju na 21 soju B. melitensis i 32 soja B. abortus došli su do sljedećeg zaključka: “Organizam koji uzrokuje undulirajuću groznicu i maltešku groznicu u koza ne može se morfološki ni biokemijski razlikovati od organizma odgovornog za zarazni pobačaj u domaćih životinja”.
Tada nisu bile dostupne molekularne metode i razlikovanje određene vrste temeljilo se na primljivosti i pojavi bolesti u određenom životinjskom domaćinu i na osnovnim fenotipskim karakteristikama. Danas razlikovanje temeljimo na detaljnijim morfološkim i biokemijskim karakteristikama poput rasta na različitim hranjivim podlogama i rast u prisutnosti boja i drugim fenotipskim karakteristikama. Vrste B. melitensis i B. abortus zadržale su svoje nazive i status kao zasebne vrste, iz praktičnih razloga i njihovog izdvajanja iz različitih domaćina i zemljopisnih područja (Scholz i Vergnaud, 2013.).
Kasnije su opisane vrste B. suis (1914.) izdvojena iz svinje, B. ovis (1953.) iz ovaca, B. neotomae (1957.) iz pustinjskog štakora i B. canis (1968.) iz pasa. Navedene vrste brucela dodane su rodu kao nove vrste. Kao i prve dvije izdvojene i vrste (B. melitensis i B. abortus) i one su klasificirane i identificirane na temelju morfoloških i biokemijskih karakteristika i primljivosti određenog domaćina. Identifikacija različitih vrsta i biovarova Brucella otežana je još i danas, jer laboratoriji tijekom tipizacije sojeva roda Brucella mogu dobiti različite rezultate primjenjujući testove za određivanje fenotipskih karakteristika.
Identifikacija i tipizacija sojeva još se više može zakomplicirati izdvajanjem sojeva Brucella koji pokazuju atipične biokemijske karakteristike, a koje se ne mogu pripisati već postojećim opisanim vrstama (Scholz i Vergnaud, 2013.).
Postoje i sojevi izdvojeni iz svinja i konja u Hrvatskoj u kojih je biokemijskim testovima potvrđeno da se radi o B. suis biovaru 3, a nakon višekratnih ponavljanja različitim molekularnim metodama dokazano je da pripadaju B. suis biovaru 1 (Cvetnić i sur., 2005., Cvetnić i sur., 2009.).
Povijest molekularnih tehnika u identifikaciji roda Brucella
Godine 1968. prva istraživanja na molekularnoj razini, metoda DNK – agara i metoda filtra, primijenjena su na članove roda Brucella (Hoyer i McCullough, 1968.). Ta su istraživanja potvrdila da B. abortus, B. melitensis i B. suis pripadaju istom rodu. Iste godine potvrđeno je da soj izdvojen iz psa pasmine bigl u Americi pripada istom rodu, a kasnije je nazvan B. canis (Carmichael i Bruner, 1968.).
Godine 1985. primjenom DNK-DNK hibridizacije potvrđena je bliska genetska povezanost različitih vrsta. Verger i sur. (1985.), potvrdili su ispitane vrste – biovarovi iz roda Brucella imali su genetsku homolognost veću od 80% i došli su do zaključka da se unutar roda Brucella treba priznati samo jednu vrstu, B. melitensis. De Ley i sur. (1987.), došli su do istog zaključka.
Pojavom metode lančane reakcije polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) i mogućnosti sekvencioniranja genoma, bliska genetska povezanost između različitih vrsta roda Brucella postala je još očitija.
Do sada postoje podatci o deset genoma koji predstavljaju samo pet vrsta brucela: B. melitensis, B. suis, B. abortus, B. ovis i B. canis. Genomi su jako slični i prema strukturi i prema sastavu gena.
Dva kružna kromosoma čine približno 3,29 Mb: kromosom I, s približno 2,11 Mb i kromosom II, s približno 1,18 Mb. Sastav GC baza približno je jednak na oba kromosoma, oko 57% (Halling i sur., 2005.).
Poznato je da B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis i B. canis imaju identične 16S ribosomske rRNK genske slijedove (Gee i sur., 2004.). Godine 2002. objavljen je prvi DNK slijed cijelog genoma Brucella (B. melitensis 16M) (DelVecchio i sur., 2002.). Nakon toga slijedio je genomski niz soja B. suis 1330 (Paulsen i sur., 2002.).
Usporedna analiza potpunog genoma potvrdila je blisku genetsku povezanost tih genoma, gdje je prosječna jednakost nukleotida bila iznad 99%. Isto tako je potvrđeno da Brucella, a osobito soj B. suis 1330 dijeli veliku sličnost s nekim biljnim patogenima i mikrobima koji žive u simbiozi s biljkama, poput Agrobacterium i Rhizobium, što može ukazivati na zajedničkog pretka vezanog uz tlo (Paulsen i sur., 2002.).
Unatoč dokazima i rezultatima usporedne genomske analize, pododbor za taksonomiju roda Brucella jednoglasno se suglasio o povratku na taksonomiju roda Brucella od prije 1986., i ponovno odobrio šest bakterijskih vrsta roda Brucella s priznatim biovarovima (Osterman i Moriyon, 2006.). Obrazloženje razloga za tu odluku temelji se na tome da su sojevi izdvojeni iz različitih domaćina gotovo uvijek grupirani u različite skupine koje pokazuju povezanost s određenim domaćinom, što dokazuje da se radi o različitim ekotipovima (Cohan, 2002.).
Tako gledajući, mogu se klasificirati kao različite vrste unatoč sekvencijskoj sličnosti (Corbel i sur., 1975.).
Nove vrste roda Brucella u genetičkoj eri
Nakon otkrića B. canis 1968. godine, rodu Brucella nisu dodavane nove vrste do 2007. godine. To zbog visokog stupnja genetske homologije među različitim vrsta roda Brucella i ograničenja fenotipskih metoda koje se koriste u identifikaciji. Rijetki kandidati koji bi mogli predstavljati novu vrstu unutar roda nije bilo moguće razlikovati od atipičnih fenotipskih varijanti unutar poznate vrste.
Ewalt i sur. (1994.), opisali su atipični novi soj roda Brucella izdvojen iz dobrog dupina (Tursiops truncatus). Nakon izdvajanja niza novih sojeva iz morskih sisavaca, predloženo je da one čine novu vrstu koja je nazvana B. maris (Jahans i sur., 1997.). Sojevi izdvojeni iz morskih sisavaca prema specifičnim fenotipskim i molekulskim karakteristikama podijeljeni su u dvije nove vrste roda Brucella (Cloeckaert i sur., 2001., Jacques i sur., 2007.). Nazvane su B. ceti i B. pinnipedialis, a prirodni domaćini su im kitovi i tuljani (Foster i sur., 2007.). Novija molekularna istraživanja pokazuju da se B. ceti i B. pinnipedialis mogu dalje podijeliti u posebne podskupine, ali bez indikacije u smislu ekotipa da bi se bilo koja od tih podskupina mogla nazvati posebnom vrstom (Bourg i sur., 2007., Dawson i sur., 2008., Maquart i sur., 2009., Zygmunt i sur., 2010.).
Godine 2008. opisana je nova vrsta izdvojena iz poljske voluharice (Microtus arvalis) koja je nazvana B. microti (Hubalek i sur., 2007., Scholz i sur., 2008.a). Nakon toga 2010. godine slijedio je opis vrste izdvojene iz endogene infekcije prsnog implantata 71-godišnje žene te je izdvojeni soj nazvan B. inopinata. Za opis i karakteristiku vrste upotrijebljen je niz fenotipskih i molekulskih analiza (De i sur., 2008., Scholz i sur., 2010.). B. microti i B. inopinata fenotipski se razlikuju od klasičnih vrsta roda Brucella i zato se često pogrešno identificiraju ako se primjenjuju samo fenotipske metode analize. B. microti i B. inopinata karakterizira brzi rast i velika metabolička aktivnost.
Stoga biokemijski sustavi biokemijskih pretraga poput API i VITEK pogrešno identificiraju obje vrste kao Ochrobactrum, koji je genetski vrlo blizak rodu Brucella (Scholz i sur., 2008.b, Scholz i sur., 2010.).
Genski slijed 16S rRNK B. microti identičan je odgovarajućim sljedovima svih drugih vrsta roda, osim B. inopinata.
Sojeve B. inopinata karakteriziraju drugačiji genski sljedovi 16S rRNK, s razlikom od pet, odnosno sedam nukleotida (Scholz i sur., 2010.). B. inopinata pokazuje značajno nižu razinu sekvencijske sličnosti u raznim genima u usporedbi s drugim vrstama roda Brucella. Isto tako B. inopinata je najdivergentnija vrsta unutar roda. Iako predstavlja najrazličitiju vrstu, dijeli DNK-DNK homolognost od 80% s B. melitensis te bi i dalje pripadala istoj vrsti primjenom opće prihvaćenih granica za podjelu (delineaciju) bakterijskih vrsta.
Uz dodatak te tri nove vrste rod Brucella trenutačno se sastoji od deset vrsta: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. neotomae, B. canis, B. ceti, B. pinnipedialis, B. microti i B. inopinata.
Moguće nove vrste roda Brucella i sličnih organizama
Primjenom suvremenih molekularnih metoda olakšava se prepoznavanje mogućih novih bakterijskih vrsta roda Brucella. Primjena tih metoda pokazala je postojanje ranije nepoznatih organizama sličnih vrstama roda brucela i mogućih novih vrsta izdvojenih iz ljudi i raznih životinjskih izvora, uključujući i nove domaćine.
Tiller i sur. (2010.a) identificirali su neobičan Brucella soj (oznaka BO2) iz biopsata pluća 52 godišnjeg muškarca iz Australije s kroničnom upalom pluća.
Fenotipskim (biokemijskim) testovima i molekularnim analizama novi je izolat po svojim karakteristikama bio vrlo sličan B. inopinata. Tiller i sur. (2010.b) molekularnim su tehnikama analizirali sedam izolata iz tri vrste glodavaca podrijetlom iz australske pokrajine Sjeverni Queensland. Navedeni izolati su ranije identificirani kao B. suis biovar 3. Izvedena je ponovna analiza radi utvrđivanja njihove točne klasifikacije.
Molekularnim tehnikama je dokazano da se radi o sedam istovjetnih sojeva i da se razlikuju od svih poznatih vrsta roda Brucella, ali su potpuno identični s ranije opisanim izolatom izdvojenim iz čovjeka oznake BO2 i vrlo je sličan s B. inopinata.
Schlabritz-Loutsevitch i sur. (2009.) prvi su izdvojili brucele iz dva mrtvorođena ploda nehumanih primata. Istraživanja su pokazala da se ta dva izolata razlikuju od svih do sada poznatih vrsta roda Brucella.
Novi atipični izolati izdvojeni su iz mandibularnih limfnih čvorova crvenih lisica u Austriji. Izdvojeni izolati sporije rastu, pokazuju vrlo nisku metaboličku aktivnost i prema biokemijskim karakteristikama ne pripadaju niti jednoj poznatoj vrsti Brucella (Hofer i sur., 2012.). Molekularnom tipizacijom temeljenom na sekvencioniranju više lokusa (MLST) i analizom sekvenci više lokusa (MLSA) utvrđen je njihov poseban položaj unutar roda Brucella (Scholz i Vergnaud, 2013.). Eisenberg i sur. (2012.) isto tako su izdvojili potencijalnu novu vrstu brucela iz afričkih bikovskih žaba. Sekvencioniranjem genoma potvrđeno je da pripadaju rodu Brucella.
Ovi podatci pokazuju mogućnosti punog ekološkog spektra roda Brucella.
Isto je tako vidljiv i znatan raspon različitih novih životinjskih vrsta koje mogu biti domaćini novih, još neopisanih vrsta Brucella ili sličnih organizama. U ovom trenutku patogeni potencijal novih potencijalnih vrsta Brucella za ljude je nepoznat kao i njihov ciklus prijenosa i održavanja u prirodi (Scholz i Vergnaud, 2013.). U razdoblju od 2003. do 2009. u Hrvatskoj su izdvojeni unikatni sojevi B. suis iz konja, svinja i divljih svinja koji su prema svojim biokemijskim osobinama bili identificirani kao biovar 3, prema građi IS711, pomoću metode AMOS PCR i kasnije Suis ladder metodom kao biovar 1, a obzirom na izrazito niski zoonotski potencijal najsličniji su bili biovaru 2. Danas, nakon što više nije utvrđen ni jedan slučaj bolesti s ovim tipom uzročnika, najbliže smo mišljenju da se radi o lokalnoj varijaciji u razvoju vrste B. suis (B. suis CroType).
Primjena molekularnih metoda u tipizaciji i identifikaciji brucela
Metode zasnovane na lančanoj reakciji polimerazom
Klasične serološke metode nisu uvijek dovoljno osjetljive i specifične, a bakteriološka pretraga je duga, zahtjevna i opasna te subjektivna. Zato se za određivanje i tipizaciju brucela danas sve češće primjenjuju molekularne metode. Lančana reakcija polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) je metoda koja samostalno ili u kombinaciji s klasičnim bakteriološkim tehnikama pruža siguran dokaz brucela u uzorcima tkiva ili bakterijskoj kulturi.
Dostupnost podataka o potpunim slijedovima genoma stvorila je prostor za dubinske molekularne analize i razvoj novih metoda. Time je omogućena identifikacija i diferencijacija roda Brucella na razini vrste i biovara te usporedba sojeva u svrhu pronalaska izvora infekcije i odgovaranja na epizootiološka i epidemiološka pitanja.
Gotovo je cijelo stoljeće jedini način određivanja brucela bila mikrobiološka pretraga.
Klasična mikrobiološka pretraga obuhvaća mikroskopsku, kulturelnu i biokemijsku pretragu (Alton i sur., 1988.). Sojevi su određivani na osnovi morfologije kolonija (sitne, konveksne, prozirne i hrapave), rastu uz prisutnost ugljikovog dioksida (CO2), rastu na podlogama s dodatkom tionina i bazičnog fuksina, proizvodnji H2S, aglutinacije s monospecifičnim protuserumima, hidrolizi uree i tipiziranju fagima (Corbel i sur., 1983., Alton i sur., 1988.).
Prve su se metode molekularne dijagnostike, tj. PCR zasnivale na dokazivanju gena 16S rRNK, što se pokazao neprikladno radi križnih reakcija s članovima roda Ochrobactrum, što je često dovodilo do zabluda u dijagnostici (Herman i Deridder, 1992., Velasco i sur., 1998., Serpe i sur., 1999.).
Bricker i Halling (1994.), razvili su jedan od prvih PCR testova kojim se mogla razlikovati većina vrsta unutar roda Brucella tzv. Abortus-Melitensis-Ovis-Suis (AMOS) PCR. Testom se ne može razlikovati svih deset vrsta (B. canis, B. neotomae, B. pinnipedialis, B. ceti, B. inopinata i B. microti), a osobito ne sve biovarove (npr. samo B. suis biovar 1). U testu se koristi početnica, ciljano usmjerena na insercijski slijed IS711 specifičan za rod Brucella, a pojavljuje se u više kopija što test čini osjetljivim (Halling i sur., 1993., Ouahrani i sur., 1993.). Mnogi su istraživači pokušali razviti nove testove koji djeluju na istom principu kao i AMOS PCR. Testovi su dali zadovoljavajuće rezultate, ali imaju bitne nedostatke, osobito što se tiče identifikacije svih biovarova B. suis i B. abortus. (Cloeckaert i sur., 2003., Al Dahouk i sur., 2007., Maquart i sur., 2008., Hinic i sur., 2009., Zygmunt i sur., 2010.).
Garcia-Yoldi i sur. (2006.) razvijaju višestruku PCR metodu s osam parova početnica u jednoj reakciji tzv. “Bruce-ladder” i ta se metoda pokazala najbolja, budući da razlikuje svih najčešćih šest kopnenih i morske vrste Brucella, ali i cjepne sojeve, a kasnije je razvijena i metoda multipleks “Bruce-lader” (Lopez-Goni i sur., 2008.). (Lopez-Goni i sur., 2011.), također razvijaju višestruki PCR „Suis-lader“ koja može razlikovati sve biovarove B. suis. (Slika 1 i 2). Mayer-Scholl i sur. (2010.) unaprijeđuju metodu, tako da su njome obuhvaćene i nove vrste poput B. microti i B. inopinata.
Sažetak
Cijelo stoljeće jedini način određivanja brucela bila je mikrobiološka pretraga.
Bakteriološka pretraga je duga, zahtjevna i opasna te ponekad subjektivna. Danas se za određivanje i tipizaciju brucela sve češće primjenjuju molekularne metode. Lančana reakcija polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) je metoda koja samostalno ili u kombinaciji s klasičnim bakteriološkim tehnikama pruža siguran dokaz brucela u materijalu ili izolatu. Metode tipiziranja, poput analize više genskih sljedova (engl. multilocus sequence analysis, MLSA), detaljno karakteriziraju strukturu brucela, potvrđuju njihovu klasičnu podjelu na genetski različite jedinke te predstavljaju početak ideje o otkrivanju polimorfizama na razini jednog nukleotidu (engl. single nucleotide polymorphism, SNP). Nakon toga razvijeno je mnoštvo testova koji se zasnivaju na SNP – ovima te omogućavaju brzu dijagnostiku na razini vrste, cjepnih sojeva te čak i nekih biovarova, koji čine različite genetske skupine.
Lokusi s različitim brojem tandemskih ponavljanja (engl. variable number tandem repeats, VNTRs) prisutni su i u bakterijskim genomima, gdje su vrlo različiti. Posljednjih godina upravo se analiza broja tandemskih ponavljanja na više lokusa (engl. multiple locus variable number of tandem repeat analysis, MLVA) ističe kao jedna dovoljno razlikovna tehnika koja zadovoljava većinu zahtjeva (jednostavnost, mogućnost tipiziranja, ponovljivost, obnovljivost, stabilnost te epidemiološku iskoristivost). Metoda se do sada pokazala kao vrlo djelotvorna, praktična i više funkcionalna. Dostupna je velikom broju istraživača i rezultati se jednostavno uspoređuju na internacionalnoj razini.
Literatura [… prikaži]
The Use of Different Molecular Methods for Typing of Species Brucella Genus (Part 1)
Željko CVETNIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Full Professor, Sanja DUVNJAK, BSc, PhD, Junior Reseacher, Maja ZDELAR-TUK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Irena REIL, DVM, Expert Associate, Boris HABRUN, DVM, PhD, Scientific Advisor, Associate Professor, Miroslav BENIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Assistant Professor, Relja BECK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Gordan KOMPES, DVM, PhD, Senior Scientific Associate, Maja STEPANČIĆ, DVM, PhD, Expert Associate, Silvio ŠPIČIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb
D uring a century microbiological examination served as an only method in brucellosis diagnostics even though it was time consuming, demanding, hazardous and in some way subjective method. Nowadays molecular techniques have become leading in either detection and/or typing brucellae.
Polymerase chain reaction (PCR) is a method which enables accurate detection and typing of brucellae in diagnostic material or from isolated culture, independently or in combination with classical microbiological methods. Typing methods such as multilocus sequence analysis (MLSA) enabled description of bacterial structure confirming their classical taxonomy and represent a clue for an idea about single nucleotide polymorphism (SNP). Hence numerous tests have been developed based on SNP. These tests enable fast diagnosis and identification of different Brucellae species, vaccinal strains even specific biovars which belong to different genetic groups. Loci with different number of tandem repeats (variable number tandem repeats VNTR) exist in bacterial genome. During the last few years multiple locus variable number of tandem repeats analysis (MLVA) has become promising differential technique fulfilling most of demands because it is simple, stabile, accurate, enables typing possibility and its results are usable in epidemiology. This method is accessible for many researchers and their results are comparable at international level.