Primjena različitih molekularnih metoda u tipizaciji vrsta roda Brucella (II. dio)

I. dio II. dio

Ž. Cvetnić, Sanja Duvnjak, Maja Zdelar-Tuk, Irena Reil, B. Habrun, M. Benić, R. Beck, G. Kompes, Maja Stepanić i S. Špičić

Dr. sc. Željko CVETNIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni redoviti profesor, dr. sc. Sanja DUVNJAK, dipl. ing., znanstvena novakinja, dr. sc. Maja ZDELAR-TUK, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, Irena REIL, dr. med. vet., stručna suradnica, dr. sc. Boris HABRUN, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni izvanredni profesor, dr. sc. Miroslav BENIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, naslovni docent, dr. sc. Relja BECK, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, dr. sc. Gordan KOMPES, dr. med. vet., viši znanstveni suradnik, Maja STEPANIĆ, dr. med. vet., stručna suradnica, dr. sc. Silvio ŠPIČIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut Zagreb

Prenešeno iz časopisa VETERINARSKA STANICA br. 46 (4), 2015.[download/preuzmi pdf ovdje]

Nespecifični molekularni testovi visoke rezolucije u tipiziranju brucela Specifični molekularni testovi visoke rezolucije u tipiziranju brucela Analiza broja uzastopnih ponavljanja na više lokusa (MLVA)Primjena molekularnih metoda u određivanje izvora i putova širenja infekcije Primjena molekularnih metoda u razlikovanju prirodnih infekcija od infekcija prouzročenih cjepnim sojevima Primjena molekularnih metoda u razlikovanju regionalnih sojeva Primjena molekularnih metoda u otkrivanju novih sojeva i vrsta Primjena molekularnih metoda u filogenetskim istraživanjima Sažetak Literatura Abstract

▲

Nespecifični molekularni testovi visoke rezolucije u tipiziranju brucela

Prof. dr. sc. Željko Cvetnić — Prof. dr. sc. **Željko Cvetnić**

Devedesetih godina 20. stoljeća korišteni su prvi alati genotipizacije na bazi PCR za istraživanje genetske raznolikosti među vrstama, biovarovima i pojedinačnim sojevima roda Brucella. Počele su se razvijati metode molekularnog podtipiziranja kao što su polimorfizam duljine restrikcijskih fragmenata (engl. polymerase chain reaction – restriction fragment lenght polymorphism, PCR-RFLP) (Al Dahouk i sur., 2005.).

Među tim metodama su enterobakterijski ponavljajući međugenski palindromski sljedovi (engl. enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR, ERIC-PCR); ponavljajući vangenski palindromski sljedovi (engl. repetitive extragenic paliandromic sequence-PCR, REP-PCR) (Mercier i sur., 1996.), nasumično umnožena DNK (engl. random amplified polymorphic DNA-PCR, RAPD-PCR; arbitrary primed-PCR, AP-PCR) (Fekete i sur., 1992., Tcherneva i sur., 2000.). Većini tih tehnika nedostaju ponovljivost i obnovljivost, ograničena je mogućnost razlikovanja pojedinih sojeva te nisu prikladni za rutinsko tipiziranje u laboratoriju.

Testovi poput gel-elektroforeze u pulsirajućem polju (engl. puls-field gel-electrophoresis, PFGE), IS711 otisak prstiju, omp tipiziranje, lančana reakcija polimerazom razasutih ponavljajućih sljedova (engl. interspersed repetitive sequence-polymerase chain reaction, IRS-PCR) i polimorfizam duljine umnoženih fragmenata (engl. amplified fragment lenght polymorphism, AFLP) iako dragocjeni, jer uspijevaju grupirati izolate u skupine koje odgovaraju biotipiziranju, ne uspijevaju postići razlikovanje na razinu ispod vrste (Vizcaino i sur., 2000., Whatmore, 2009.).

▲

Specifični molekularni testovi visoke rezolucije u tipiziranju brucela

Lančana reakcija polimerazom upotrijebljena je kao oruđe za određivanje na molekularnoj razini, ali sojevi Brucella sp. pokazuju vrlo visoku razinu genetske homolognosti (> 90%).
Zato se pribjeglo razvijanju metoda molekularnog tipiziranja.

Metode tipiziranja poput analize više genskih sljedova (engl. multilocus sequence analysis, MLSA) detaljno karakterizira strukturu Brucella sp., potvrđuje njihovu klasičnu podjelu na genetski različite jedinke te predstavlja početak ideje o otkrivanju polimorfizama u jednom nukleotidu (engl. single nucleotide polymorphism, SNP). Nakon toga razvijeno je mnoštvo testova koji se zasnivaju na SNP – ovima te omogućavaju brzu dijagnostiku na razini vrste, cjepnih sojeva te čak i nekih biovarova, koji čine različite genetske skupine (Foster i sur., 2008., Gopaul i sur., 2008., Schlabritz-Loutsevitch i sur., 2009., Tiller i sur., 2010.).

Svi navedeni testovi ne omogućavaju epidemiološko praćenje sojeva, razlikovanje regionalne specifičnosti sojeva, brzo filogenetsko otkrivanje novih sojeva te razlikovanje biovarova pojedinih vrsta, osobito onih B. melitensis, upravo zbog vrlo visoke homolognosti. Kod rodova slične, ako ne i veće homolognosti već se intenzivno iskorištava prisutnost uzastopnih ponavljanja pojedinih sljedova u DNK. Isto se pokušalo napraviti i kod Brucella sp. (Bricker i sur., 2003., Le Fleche i sur., 2006., Whatmore i sur., 2006., Al Dahouk i sur., 2007., Whatmore i sur., 2007.). Do sada se tipiziranje na osnovu uzastopnih ponavljajućih sljedova pokazalo jako korisno u razlikovanju infekcija (Marianelli i sur., 2008., Valdezate i sur., 2010.), poput recidivirajućih od novih infekcija (Al Dahouk i sur., 2005., Kattar i sur., 2008.), u dokazivanju izvora infekcija (Valdezate i sur., 2007., Lucero i sur., 2010.), u povezivanju različitih genotipova s različitim profilima patogenosti (Nöckler i sur., 2009.) te u procjenjivanju stabilnosti pojedinih cjepnih pripravaka (Garcia-Yoldi i sur., 2007.).

▲

Analiza broja uzastopnih ponavljanja na više lokusa (MLVA)

Lokusi s različitim brojem uzastopnih ponavljanja (engl. variable number tandem repeats, VNTRs) prisutni su i u bakterijskim genomima, gdje su vrlo različiti čak i u monomorfnih vrsta, kao što su vrste Mycobacterium tuberculosis kompleksa, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis ili Brucella.

Uzastopna ponavljanja sastoje se od različitog broja ponavljanja savršenih ili nesavršenih kopija elementarne jedinice te čine alele u različitim bakterijskim sojevima unutar pojedine vrste. Otisci prsta nastali proučavanjem različitih lokusa mogu biti vrlo razlikovni, ako ne i jedinstveni. Analiza ovisi o izboru biljega, koji pojedinačno ne bi bili dovoljno informativni, bili bi prerazličiti ili vrlo homoplastični. Posljednjih godina upravo analiza broja uzastopnih ponavljanja na više lokusa (engl. multiple locus variable number of tandem repeat analysis, MLVA) ističe se kao jedna dovoljno razlikovna tehnika koja zadovoljava većinu zahtjeva (jednostavnost, mogućnost tipiziranja, ponovljivost, obnovljivost, stabilnost te epidemiološku iskoristivost).
Dostupna je velikom broju istraživača i rezultati se jednostavno uspoređuju na internacionalnoj razini. Postaje jako epidemiološko oruđe redovitim popunjavanjem internacionalne baze podataka što bi moglo rezultirati učinkovitijim nadzorom i kontrolom ove zoonoze (Whatmore i sur., 2006.).

Uspoređene su tri trenutačno dostupne genomske knjižnice te su iz 107 uzastopnih ponavljanja s elementarnom jedinicom većom od 5 bp, a koji su pokazivali polimorfizam, izabrali 15 biljega. To je bila kombinacija umjereno varijabilnih 8 minisatelita (Panel 1), koji mogu dobro odrediti vrstu, i 7 razlikovnih mikrosatelita (Panel 2), koji omogućavaju razlikovanje na razini soja jer su mnogo varijabilniji. Soj B. melitensis 16M koristi se u pretrazi kao referentni soj za usporedbu i provjeru kvalitete testa. Nadalje, dokazali su da je test jednostavan, brz, može se provoditi na velikom broju sojeva, automatizirano ili ručno te da može zamijeniti klasične biotipizacijske metode (Le Fleche i sur., 2006.). Također, MLVA se izvodi na nezaraznom materijalu za razliku od biotipizacijskih metoda koje zahtjevaju rad sa živim bakterijama. Dobiveni podatci lako se uspoređuju unutar ili među laboratorijski te na taj način daju važne epidemiološke informacije (Whatmore i sur., 2006.).
Slijede primjene ove metode za određivanje sojeva Brucella sp., ne samo životinjskog već i humanog podrijetla te i njegovo proširenje na 16 lokusa. Metoda se do sada pokazala kao vrlo djelotvorna, praktična i više funkcionalna. Koristila se za dokazivanje izvora zaraze, pri razlikovanju ponovnih zaraza od povratnih te zaraza cjepnim sojevima od spontanih zaraza, na sojevima životinjskog i ljudskog podrijetla (Garcia-Yoldi i sur., 2006., Kattar i sur., 2008.).

Načinjena je internacionalna baza podataka (http://mlva.u-psud.fr) na Sveučilištu Paris Sud u Orsayu 2006. godine koja sadrži otiske prstiju izolata Brucella sp. iz različitih zemljopisnih regija i pripadajuće epidemiološke podatke te omogućava učinkovit nadzor i kontrolu ove aktualne zoonoze. Baza sadrži podatke od više tisuća izolata (Grisa i sur., 2008.).

▲

Primjena molekularnih metoda u određivanje izvora i putova širenja infekcije

Glavni preduvjeti za iskorjenjivanje bilo koje zarazne bolesti pa tako i bruceloze je određivanje izvora i puteva širenja infekcije. Nužno je preispitivati izolate na razini soja i to tehnikama koje se zasnivaju na lokusima koji imaju vrlo visoki indeks raznolikosti, tj. pokazuju vrlo visoku razinu mutacije.
Najprikladnija i u tu svrhu već više puta dokazana tehnika je MLVA, koja omogućava praćenje sojeva na lokalnoj razini te uspoređivanje s internacionalnim podatcima, kako bi se utvrdilo kako je taj soj najvjerojatnije dospio u pojedinu regiju (Al Dahouk i sur., 2005., Marianelli i sur., 2008., Kattar i sur., 2008., De Santis i sur., 2009., Her i sur., 2009.).

▲

Primjena molekularnih metoda u razlikovanju prirodnih infekcija od infekcija prouzročenih cjepnim sojevima

Često programi iskorjenjivanja bruceloze uključuje kvalitetnu i trajnu kontrolu inficiranih stada te sprječavanje zaraze cijepljenjem. Svjetska organizacija za zdravlje životinja (engl. World organization for animal health ili fran. Office international des epizooties, OIE) preporučuje tri cjepna soja (B. abortus RB51 i S19 i B. melitensis Rev1) za kontrolu i zaštitu od bruceloze u preživača (Garin-Bastuji i Blasco, 2008., Nielsen i Ewalt, 2008.). Međutim, ta cjepiva su patogena za ljude te se u tu svrhu ni ne preporučuju (Godfroid i sur., 2005.). Prilikom uporabe cjepiva u životinja, nužno je razaznati potiču li protutijela, čija je prisutnost potvrđena serološkim testovima od cijepljenja ili spontane infekcije.

Serološkim testovima to nije moguće dokazati. Od dostupnih molekularnih metoda i tipizacije danas se najčešće prvo upotrebljava klasična PCR tehnika tzv. “Bruce-ladder” (Lopez-Goni i sur., 2008.), koja razlikuje cjepne sojeve od divljih. U tu svrhu koristi se i MLVA tehnika, koja jako dobro može razlikovati i podrijetlo soja korištenog pri izradi cjepiva.

Najnovija istraživanja pokazuju da je taj podatak možda suvišan s obzirom da kvalitetno čuvani cjepni sojevi pokazuju minimalnu ili nikakvu razinu mutacije (Garcia-Yoldi i sur., 2006.).

Za razlikovanje ovakvih zaraza nužno je tipiziranje na razini soja. Od svih trenutačno dostupnih tehnika najučinkovitijom se pokazala upravo MLVA, bilo da se radi o “HOOF-Prints” (Valdezate i sur., 2007.) ili MLVA-16 (Al Dahouk i sur., 2007., Kattar i sur., 2008.).
Te tehnike se zasnivaju na praćenju uzastopnih ponavljanja, koja relativno brzo mutiraju te se mogu detaljnije pratiti u kraćem razdoblju.

▲

Primjena molekularnih metoda u razlikovanju regionalnih sojeva

Slika 1. Filogenetsko stablo koje pokazuje odnose između tipova sljedova. Stablo je napravljeno na osnovi uobičajenih statističkih metoda za određivanje genetskih udaljenosti (Whatmore i sur., 2007.).

Reginalna posebnost pojedinih sojeva posljedica je kruženja istog genetskog materijala u određenoj regiji. Iz tog razloga pojavljuju se sojevi koji su specifični samo za to područje te se u tom predjelu pojavljuju s vrlo visokom učestalosti.

S obzirom da se izolati moraju pratiti na razini soja, nužne su podtipizacijske metode, MLVA i tipizacija više genskih sljedova (engl. multilocus sequence typing, MLST). MLST je tehnika koja koristi biljege sa sporim molekularnim satom, tj. razina razvoja mutacija na praćenim genskim lokusima je niska pa praćenje sojeva u kratkom razdoblju ne bi pokazalo nikakvu razliku. MLVA koristi biljege s vrlo brzom razinom mutacija te je puno prikladnija za lokalna epidemiološka istraživanja (Whatmore i sur., 2009.).

▲

Primjena molekularnih metoda u otkrivanju novih sojeva i vrsta

Svim danas dostupnim metodama, neovisno o njihovoj mogućnosti razlikovanja izolata na razini soja i njihovoj obnovljivosti, zajednička je činjenica da uz upražnjavanje kvalitetnih biljega daju rezultate, u većini slučajeva, vrlo slične onima dobivenim biotipiziranjem. Ipak, MLVA, upravo zbog lakog spremanja i uspoređivanja podataka, pokazala se jako važnom u taksonomske svrhe. Naime, upravo zbog izbora biljega koji pokrivaju i sporo i brzo evoluirajuće lokuse, omogućavaju otkrivanje novih vrsta i sojeva. To se pokazalo jako prikladno u otkrivanju sojeva morskih sisavaca (Grossaud i sur., 2007., Whatmore i sur., 2008.), ali i u potvrđivanju zadnjih otkrivenih vrsta B. microti i B. inopinata (Scholz i sur., 2008.). Veliku ulogu ovdje igra izrađena, iako još uvijek manja, ali široko dostupna, internacionalna baza podataka (Whatmore i sur., 2009.).

▲

Primjena molekularnih metoda u filogenetskim istraživanjima

S obzirom na mogućnost obuhvata velike količine podataka i njihove usporedbe, danas se koriste dvije najupotrebljivanije metode za praćenje izolata na razini soja, MLVA i MLST. Oba pristupa vrlo dobro razlikuju definirane skupine kojima pripadaju sojevi B. abortus, B. ovis, B. neotomae i B. melitensis te potvrđuju filogenetski vrlo blisku povezanost B. suis biovar 3 i 4 s B. canis, a B. suis biovar 5 smještaju udaljenije od skupine B. suis. Uz mala odstupanja, skupina Brucella sp. morskih sisavaca ima svoju granu. Razlika je u tome dijeli li se na tri podskupine ili ne, ovisno o korištenom pristupu (Le Fleche i sur., 2006., Whatmore i sur., 2007., Groussarud i sur., 2007.).

Podatci dobiveni ovim tehnikama vrlo su važni u određivanju filogenetske povezanosti pojedinih vrsta, biovarova pa čak i sojeva te mogu objasniti i neke nedoumice o nemogućnosti određivanja nekih biljega specifičnih za pojedinu vrstu, poput B. suis (Moreno i sur., 2002.).

U Hrvatskom veterinarskom institutu postoji baza podataka molekularnog tipiziranja izolata izdvojenih od 1947. do danas na području Republike Hrvatske.
Uglavnom se radi o vrsta B. melitensis, B. abortus, B. suis i B. ovis i interpretacija rezultata u okviru epidemioloških istraživanja danas je i nama od velike koristi. Također, usporedbom s genotipovima, prije svega iz nama susjednih zemalja, dobiva se uvid u tendencije i puteve širenja bolesti što omogućava gotovo trenutnu reakciju s ciljem zaštite zdravlja nacionalnog stada.

▲

Sažetak

Cijelo stoljeće jedini način određivanja Brucella sp. bila je mikrobiološka pretraga.
Bakteriološka pretraga je duga, zahtjevna i opasna te ponekad subjektivna. Danas za određivanje i tipizaciju Brucella sp. se sve češće primjenjuju molekularne metode. Lančana reakcija polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) je metoda koja samostalno ili u kombinaciji s klasičnim bakteriološkim tehnikama pruža siguran dokaz Brucella sp. u materijalu ili izolatu. Metode tipiziranja poput analize više genskih sljedova (engl. multilocus sequence analysis, MLSA) detaljno karakterizira strukturu Brucella sp., potvrđuje njihovu klasičnu podjelu na genetski različite jedinke te predstavlja početak ideje o otkrivanju polimorfizama na razini jednog nukleotida (engl. single nucleotide polymorphism, SNP).

Nakon toga razvijeno je mnoštvo testova koji se zasnivaju na SNP – ovima te omogućavaju brzu dijagnostiku na razini vrste, cjepnih sojeva te čak i nekih biovarova, koji čine različite genetske skupine. Lokusi s različitim brojem tandemskih ponavljanja (engl. variable number tandem repeats, VNTRs) prisutni su i u bakterijskim genomima, gdje su vrlo različiti.

Posljednjih godina upravo analiza broja tandemskih ponavljanja na više lokusa (engl. multiple locus variable number of tandem repeat analysis, MLVA) ističe se kao jedna dovoljno razlikovna tehnika koja zadovoljava većinu zahtjeva (jednostavnost, mogućnost tipiziranja, ponovljivost, obnovljivost, stabilnost te epidemiološku iskoristivost). Metoda se do sada pokazala kao vrlo djelotvorna, praktična i više funkcionalna. Dostupna je velikom broju istraživača i rezultati se jednostavno uspoređuju na internacionalnoj razini.

Literatura [… prikaži]

▲

1. AL DAHOUK, S., H. TOMASO, E. PRENGER-BERNINGHOFF, W. D. SPLETTSTOESSER, H. C. SCHOLZ and H. NEUBAUER (2005): Identification of Brucella species and biotypes using polymerase chain reaction–restriction fragment lengthpolymorphism (PCR–RFLP). Crit. Rev. Microbiol. 31, 191-196.
2. AL DAHOUK, S., P. LE FLECHE, K. NÖCKLER, I. JACQUES, M. GRAYON, H. C. SCHOLZ, H. TOMASO, G. VERGNAUD and H. NEUBAUER (2007): Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis. J. Microbiol. Meth. 69, 137-145.
3. BRICKER, B. J., D. R. EWALT and S. M. HALLING (2003): Brucella ‘HOOF-prints’: straintyping by multi-locus analysis of variable number tandem repeats (VNTRs). BMC Microbiol. 3, 15-27.
4. DE SANTIS, R., A. CIAMMARUCONI, G. FAGGIONI, R. D’AMELIO, C. MARIANELLI and F. LISTA (2009): Lab on a chip genotyping for Brucella spp. based on 15-loci multi locus VNTR analysis. BMC Microbiol. 9, 66-70.
5. FEKETE, A., J. A. BANTLE, S. M. HALLING and W. R. STICH (1992): Amplification fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers. J. Bacteriol. 23, 7778-7783.
6. FOSTER, J. T., R. T. OKINAKA, R. SVENSSON, K. SHAW, B. K. DE, R. A. ROBISON, W. S. PROBERT, W. D. BROWN and P. KEIM (2008): Real-time PCR assays of single-nucleotide polymorphisms defining the major Brucella clades. J. Clin. Microbiol. 46, 296-301.
7. GARCIA-YOLDI, D., C. M. MARIN, M. J. DE MIGUEL, P. M. MUNOZ, J. L. VIZMANOS and I. LOPEZ – GONI (2006): Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucella species and the vaccine strains Brucella abortus S19 and RB51 and Brucella melitensis Rev 1. Clin. Chem. 52, 779-781.
8. GARCIA-YOLDI, D., P. LE FLECHE, M. J. DE MIGUEL, P. M. MUNOZ, J. M. BLASCO, Z. CVETNIC, C. M. MARIN, G. VERGNAUD and I. LOPEZ – GONI (2007): Comparison of multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis with other PCR-based methods for typing Brucella suis isolates. J. Clin. Microbiol. 45, 4070-4072.
9. GARIN-BASTUJI, B. and J. M. BLASCO (2008): Caprine and ovine brucellosis (excluding Brucella ovis). In: Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 6 th edn. OIE, Paris, France. Pp. 974-982.
10. GODFROID, J., A. CLOECKAERT, J. P. LIAUTARD, S. KOHLER, D. FRETIN, K. WALRAVENS, B. GARIN-BASTUJI and J. J. LETESSON (2005): From the discovery of the Malta fever’s agent to the discovery of a marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging zoonosis. Vet. Res. 36, 13-25.
11. GOPAUL, K. K., M. S. KOYLASS, C. J. SMITH and A. M. WHATMORE (2008): Rapid identification of Brucella isolates to the species level by realtime PCR based single nucleotide polymorphism (SNP) analysis. BMC Microbiol. 8, 86-99.
12. GRISSA, I., P. BOUCHON, C. POURCEL and G. VERGNAUD (2008): On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing. Biochimie 90, 660-668.
13. GROUSSAUD, P., S. J. SHANKSTER, M. S. KOYLASS and A. M. WHATMORE (2007): Molecular typing divides marine mammal strains of Brucella into at least three groups with distinct host preferences. J. Med. Microbiol. 56, 1512-1518.
14. HER, M., S. I. KANG, D. H. CHO, Y. S. CHO, I. Y. HWANG, Y. R. HEO, S. C. JUNG and H. S. YOO (2009): Application and evaluation of the MLVA typing assay for the Brucella abortus strains isolated in Korea. BMC Microbiol. 9, 230-242.
15. KATTAR, M. M., R. F. JAAFAR, G. F. ARAJ, P. LEFLECHE, G. M. MATAR, R. A. RACHED, S. KHALIFE and G. VERGNAUD (2008): Evaluation of a multilocus variable- number tandem-repeat analysis scheme for typing human Brucella isolates in a region of brucellosis endemicity. J. Clin. Microbiol. 46, 3935-3940.
16. LE FLÈCHE, P., I. JACQUES, M. GRAYON, S. AL DAHOUK, P. BOUCHON, F. DENOEUD, K. NÖCKLER, H. NEUBAUER, L. A. GUILLOTEAU and G. VERGNAUD (2006): Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay. BMC Microbiol. 6, 9-22.
17. LOPEZ-GONI, I., D. GARCIA-YOLDI, C. M. MARIN, M. J. DEMIGUEL, P. M. MUNOZ, J. M. BLASCO, I. JACQUES, M. GRAYON, A. CLOECKAERT, A. C. FERREIRA, R. CARDOSO, M. DESA, K. WALRAVENS, D. ALBERT and B. GARIN-BASTUJI (2008): Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 46, 3484-3487.
18. LUCERO, N. E., R. CORAZZA, M. N. ALMUZARA, E. REYNES, G. I. ESCOBAR, E. BOERI and S. M. AYALA (2010) Human Brucella canis outbreak linked to infection in dogs. Epidemiol. Infect. 138, 280-285.
19. MARIANELLI, C., A. PETRUCCA, P. PASQUALI, F. CIUCHINI, S. PAPADOPOULOU and P. CIPRIANI (2008): Use of MLVA-16 typing to trace the source of a laboratory-acquired Brucella infection. J. Hosp. Infect. 68, 274-276.
20. MERCIER, E., E. JUMAS-BILAK, A. ALLARDET-SERVENT, D. O’CALLAGHAN and M. RAMUZ (1996): Polymorphism in Brucella strains detected by studying distribution of two short repetitive DNA elements. J. Clin. Microbiol. 34, 1299-1302.
21. MORENO, E. (2002): Brucellosis in Central America. Vet. Microbiol. 90, 31-38.
22. NIELSEN, K. and D. R. EWALT (2008): Chapter 2.4.3. Bovine Brucellosis.In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 6 th edition. OIE, Paris, France, pp. 624-660.
23. NÖCKLER, K., R. MAVES, D. CEPEDA, A. DRAEGER, A. MAYER-SCHOLL, J. CHACALTANA, M. CASTANEDA, B. ESPINOSA, R. CASTILLO, E. HALL, S. AL DAHOUK, R. H. GILMAN, F. CABEZA and H. L. SMITS (2009) Molecular epidemiology of Brucella genotypes in patients at a major hospital in Central Peru. J. Clin. Microbiol. 47, 3147-3155.
24. SCHLABRITZ–LOUTSEVITCH, N. E., A. M. WHATMOREW, C. R. QUANCE, M. S. KOYLASS, L. B. CUMMINS, E. J. DICK, C. L. SNIDER, D. CAPPELLI, J. L. EBERSOLE, P. W. NATHANIELSZ and G. B. HUBBARD (2009): A novel Brucella isolate in association with two cases of stillbirth in non-human primates – first report. J. Med. Primatol. 38, 70-73.
25. SCHOLZ, H. C., Z. HUBALEK, J. NESVADBOVA, H. TOMASO, G. VERGNAUD, P. LE FLÈCHE, A. M. WHATMORE, S. AL DAHOUK, M. KRÜGER, C. LODRI and M. PFEFFER (2008): Isolation of Brucella microti from soil. Emerg. Infect. Dis. 14, 1316-1317.
26. TCHERNEVA, E., N. RIJPENS, C. NAYDENSKY and L. HERMAN (2000): Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis. J. Appl. Microbiol. 88, 69-80.
27. TILLER, R. V., J. E. GEE, M. A. FRACE, T. K. TAYLOR, J. C. SETUBAL, A. R. HOFFMASTER and B. K. DE (2010): Characterization of novel Brucella strains originating from wild native rodent species in North Queensland, Australia. Appl. Environ. Microb. 76, 5837-5845.
28. VALDEZATE, S., I. CERVERA, P. HERNANDEZ, A. NAVARRO and J. A. S. NIETO (2007): Characterisation of human outbreaks of brucellosis and sporadic cases by the use of hyper-variable octameric oligonucleotide fingerprint (HOOF) variable number tandem repeats. Clin. Microbiol. Infect. 13, 887-892.
29. VALDEZATE, S., A. NAVARRO, P. VILLALON, G. CARRASCO and J. A. SAEZ-NIETO (2010): Epidemiological and phylogenetic analysis of Spanish human Brucella melitensis strains by multiple-locus variable-number tandem-repeat typing, hypervariable octameric oligonucleotide fingerprinting, and rpoB typing. J. Clin. Microbiol. 48, 2734-2740.
30. VIZCAINO, N., A. CLOECKAERT, J. M. VERGER, M. GRAYON and L. FERNANDEZ-LAGO (2000): DNA polymorphism in the genus Brucella. Microbes Infect. 2, 1089-1100.
31. WHATMORE, A. M., S. J. SHANKSTER, L. L. PERRETT, T. J. MURPHY, S. D. BREW, R. E. THIRLWALL, S. J. CUTLER and A. P. MacMILLAN (2006): Identification and characterization of variable-number of tandem-repeat markers for typing of Brucella spp. J. Clin. Microbiol. 44, 1982-1993.
32. WHATMORE, A. M., L. L. PERRETT and A. P. MacMILLAN (2007): Characterisation of the genetic diversity of Brucella by multilocus sequencing. BMC Microbiol. 7, 34-48.
33. WHATMORE, A. M., C. E. DAWSON, P. GROUSSAUD, M. S. KOYLASS, A. C. KING, S. J. SHANKSTER, A. H. SOHN, W. S. PROBERT and W. L. McDONALD (2008): Marine mammal Brucella genotype associated with zoonotic infection. Emerg. Infect. Dis. 14, 517-518.
34. WHATMORE, A. M. (2009): Current understanding of the genetic diversity of Brucella, an expanding genus of zoonotic pathogens. Infect. Genet. Evol. 9, 1168-1184.

▲

The Use of Different Molecular Methods for Typing of Species Brucella genus (Part 2)

Željko CVETNIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Full Professor, Sanja DUVNJAK, BSc, PhD, Junior Reseacher, Maja ZDELAR-TUK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Irena REIL, DVM, Expert Associate, Boris HABRUN, DVM, PhD, Scientific Advisor, Associate Professor, Miroslav BENIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Assistant Professor, Relja BECK, DVM, PhD, Scientific Advisor, Gordan KOMPES, DVM, PhD, Senior Scientific Associate, Maja STEPANČIĆ, DVM, PhD, Expert Associate, Silvio ŠPIČIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

During whole century microbiological examination served as an only method in brucellosis diagnostics even though it was time consuming, demanding, hazardous and in some way subjective method. Nowadays molecular techniques have become leading in either detection and/or typing Brucellae.
Polymerase chain reaction (PCR) is a method which enables accurate detection and typing of Brucellae in diagnostic material or from isolated culture, independently or in combination with classical microbiological methods. Typing methods such as multilocus sequence analysis (MLSA) enabled description of bacterial structure confirming their classical taxonomy and represented a clue for an idea about single nucleotide polymorphism (SNP).
Hence numerous tests have been developed based on SNP. These tests enable fast diagnosis and identification of different Brucellae species, vaccinal strains even specific biovars which belong to different genetic groups.
Loci with different number of tandem repeats (variable number tandem repeats VNTR) exist in bacterial genome. During the last few years multiple locus variable number of tandem repeats analysis (MLVA) has become promising differential technique fulfilling most of demands because it is simple, stabile, accurate, enables typing possibility and its results are usable in epidemiology. This method is accessible for many researchers and their results are comparable at international level.