The use of meat juice serology in the diagnostics of invasive protist Toxoplasma gondii in slaughterhouse processed pigs
Fuštin, D., M. Kiš, D. Ovničević, T. Zubak, N. Zdolec*
Dunja FUŠTIN, dr. med. vet., stručni suradnik, KRKA-FARMA d.o.o., Radnička cesta 48, 10000 Zagreb, Marta KIŠ, dr. med. vet, asistent, Zavod za higijenu tehnologiju i sigurnost hrane, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Domagoj OVINČEVIĆ, dr. med. vet., ovlašteni veterinar, Veterinarska stanica Valpovo, Tomislav ZUBAK, dr. med. vet., ovlašteni veterinar, Veterinarska stanica Jastrebarsko, dr. sc. Nevijo ZDOLEC, dr. med. vet., redoviti profesor, Zavod za higijenu tehnologiju i sigurnost hrane, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Dopisni autor: nzdolec@vef.hr
Sažetak
T renutačno obveznim makroskopskim pregledom mesa nije moguće detektirati najčešće uzročnike bolesti koji se prenose svinjskim mesom (Salmonella spp., Yersinia enterocolitica i Toxoplasma gondii), pa je nužno koristiti se odabranim epidemiološkim indikatorima rizika od farme do klaonice. Stoga je cilj ovog istraživanja bio utvrditi seroprevalenciju T. gondii u mesnom soku, iz ošita svinja uzetog prilikom klaoničke obrade. Komercijalnim testom ELISA pretražen je ukupno 91 uzorak mesnog soka domaćih svinja, od kojih 54 potječu s 18 velikih svinjogojskih farmi te 37 iz 18 malih obiteljskih farmi. Protutijela za T. gondii pronađena su u 13 % svinja i na 17 % farmi. T. gondii seropozitivne svinje potjecale su samo s malih obiteljskih farmi (P < 0,05). Kategorija biosigurnosti farmi imala je utjecaj na seroprevalenciju T. gondii.
Ključne riječi: serologija, mesni sok, Toxoplasma gondii, svinje, klaonica.
Abstract
Currently, mandatory macroscopic examination of meat cannot detect the most common pork-borne pathogens (Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, and Toxoplasma gondii), making it necessary to use selected epidemiological risk indicators from farm to slaughterhouse. Therefore, the aim of this study was to determine the seroprevalence of T. gondii in meat juice from pig diaphragms collected during processing at the slaughterhouse. A total of 91 meat juice samples from domestic pigs were analyzed using a commercial ELISA assay, of which 54 were from 18 large pig farms and 37 from 18 small family farms. Antibodies to T. gondii were found in 13% of the pigs and 17% of the farms. The T. gondii seropositive pigs were only from small family farms (P < 0.05). The biosecurity category of the farm had an influence on the seroprevalence of T. gondii.
Key words: serology, meat juice, Toxoplasma gondii, pigs.
Uvod
Premda se tijekom godina svrha inspekcije mesa nije promijenila, znatno su se promijenile prioritetne biološke i kemijske opasnosti koje utječu na sigurnost mesa. Trenutačno su prioritetne biološke opasnosti, prema provedenoj analizi rizika EFSA-e u proizvodnji mesa na razini farme i klaonica, bakterije Salmonella spp., Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica, verotoksična Escherichia coli te paraziti Trichinella spp. i Toxoplasma gondii (EFSA, 2011.). Problem kontrole ovih bioloških opasnosti u lancu proizvodnje mesa jest njihova prisutnost u latentno inficiranih i invadiranih asimptomatskih životinja (EFSA, 2011.; Zdolec i Kiš, 2021.). S obzirom na njihovu ograničenu kontrolu u inspekciji mesa, osim za Trichinella spp., novi pristup koji se temelji na stvaranju dostatne baze podataka o seroprevalenciji tih uzročnika bolesti u svinja na farmi, mogao bi pomoći u kontroli i osmišljavanju intervencijskih mjera u klaonicama (Kiš i sur., 2021.a). Uzorkovanje ošita na liniji klanja i određivanje seroprevalencije više patogena iz jednog uzorka pokazalo se vrlo praktičnim i isplativim (Meemken i sur., 2014.). Tom je metodom primjerice nedavno utvrđena prevalencija Salmonella spp. u 48 % svinja i na 64 % farmi te Yersinia spp. u 13 % svinja na 28 % odabranih farmi u Hrvatskoj (n = 36), pri čemu nije bilo značajnih razlika u seroprevalenciji između velikih farmi svinja i obiteljskih gospodarstava (Kiš i sur., 2023.).
Sigurnost mesa bitno je uvjetovana farmskom praksom, odnosno provođenjem mjera sprečavanja unosa i/ili širenja uzročnika u populaciji svinja. Primjerice, održivost intenzivne svinjogojske proizvodnje u javnozdravstvenom smislu primarno se oslanja na stroge unutarnje i vanjske biosigurnosne mjere (Vučemilo i sur., 2004.). Manje, obiteljske farme s manjim brojem svinja i u pravilu lošijom farmskom praksom također zahtijevaju provođenje specifičnih biosigurnosnih mjera i drugih preventivnih postupaka. U Hrvatskoj je biosigurnosna kategorizacija svinjogojskih farmi, tj. gospodarstava započela prije nekoliko godina i prvi su podaci pokazali da je oko 50 % njih u najnižoj kategoriji (Acinger-Rogić, 2019.).
Potrebno je naglasiti da neki specifični pokazatelji biosigurnosti i općenito upravljanje farmom, poput infrastrukture, ispusta i pristupa divljim životinjama, načina hranidbe i korištenja vode (bunarska ili javna), postupanje s otpadom, mjere deratizacije i dr. mogu utjecati i na prevalenciju spomenutih bioloških opasnosti u lancu proizvodnje svinjskoga mesa, uključujući T. gondii (Dewulf i van Immerseel, 2019).
Stoga je cilj ovog rada bio istražiti seroprevalenciju T. gondii primjenom serološke pretrage mesnog soka ošita (uzorkovanog na liniji klanja) svinja iz različitih sustava držanja i biosigurnosnih statusa farmi, tj. gospodarstava.
Materijali i metode
Uzorkovanje
Uzorkovanje ošita svinja obavljeno je metodom jednostavnog nasumičnog odabira u lokalnim klaonicama (klaonica I i II) u razdoblju od rujna 2021. do ožujka 2022. Ukupno je pretražen 91 uzorak mesnog soka domaćih svinja, od kojih je 54 potjecalo s 18 velikih svinjogojskih farmi te 37 s 18 seoskih domaćinstava. Uzorci su pohranjivani u sterilne vrećice i transportirani u prijenosnom hladnjaku u Zavod za higijenu, tehnologiju i sigurnost hrane Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Kategorizacija farmi/gospodarstava s obzirom na biosigurnost temeljila se na službenom upitniku i registru farmi: kategorija 1 – ne udovoljavaju uvjetima; kategorija 2 – djelomično udovoljavaju uvjetima; kategorija 3 – u potpunosti udovoljavaju uvjetima; kategorija 4 – drže svinje na otvorenome i koja su odobrena od nadležnog veterinarskog inspektora.
Serološka pretraga mesnog soka
Priprema mesnog soka za detekciju protutijela komercijalnim ELISA kitovima
Uzorci ošita svinja s linije klanja mase oko 10 grama istog su dana uzorkovanja zamrznuti na -20 °C.
Potom su premješteni u vrećice za homogenizaciju i odmrzavani pri 4 °C tijekom 24 h ± 4 h. Nakon prikupljanja 1 mL mesnog soka iz svakog uzorka mesni je sok pretočen u plastične kivete od 1,5 mL i ponovno zamrzavan na -20 °C do početka analize.
Postupak detekcije protutijela komercijalnim ELISA kitovima
Prisutnost IgG protutijela protiv protista T. gondii određena je komercijalnim ELISA dijagnostičkim kitom s inaktiviranim antigenom (Indical Bioscience GmbH, Germany). Uzorci mesnog soka razrjeđivani su u omjeru 1 : 10 prema uputi proizvođača. U jažice mikrotitracijske pločice koje su obložene specifičnim antigenom dodano je 100 μL uzorka te je potom sve inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon inkubacije jažice su ispirane tri puta s razrijeđenom otopinom za ispiranje (1 : 10) te je u svaku dodano 100 μL konjugata. Nakon inkubacije (30 minuta na sobnoj temperaturi) i drugog ispiranja, 100 μL TMB supstrata dodano je u svaku jažicu te su potom inkubirani na sobnoj temperaturi bez izlaganja svjetlosti. Reakcija je zaustavljena nakon 10 minuta dodavanjem 100 μL STOP otopine. Nakon cjelokupne procedure očitana je apsorbancija pomoću čitača mikropločica (BioTek ELx800) i analizirana pomoću Gen5™ softvera (BioTek Instruments, Inc.). Izračunat je S/P omjer za svaki uzorak te su uzorci sa S/P omjerom ≥ 0,3 smatrani pozitivnim. S/P omjer upućuje na razinu protutijela u odnosu na izmjerenu pozitivnu i negativnu kontrolu.
Nakon što je izračunata srednja vrijednost dobivenih apsorbancija za pozitivnu i negativnu kontrolu, S/P omjer uzorka izračunat je prema formuli: S/P=(OD sample-MV OD nc)/(MV OD pc-MV OD nc)
• pri čemu je OD optička gustoća (engl. optical density), MV srednja vrijednost (engl. mean value), nc negativna kontrola (engl. negative control), a pc pozitivna kontrola (engl. positive control).
Statistička obrada
Statistički značajne razlike u seroprevalenciji T. gondii s obzirom na veličinu farme i njezinu kategoriju biosigurnosti utvrđivane su Fisherovim egzaktnim testom na razini P = 0,05.
Rezultati
Od ukupno 91 pretraženog uzorka mesnog soka svinja 13 % bilo je pozitivno, tj. imalo je protutijela protiv T. gondii, pri čemu su sve seropozitivne svinje potjecale sa seoskih domaćinstava (P < 0,05).
Od ukupnog broja farmi u istraživanju 17 % ih je pozitivno, odnosno svako treće seosko gospodarstvo (33 %).
Seroprevalencija T. gondii razlikuje se između kategorija biosigurnosti farme. Naime u kategoriji 3 i 4 nisu pronađene pozitivne svinje, a u kategoriji 2 zamijećena je značajno veća seroprevalencija (P < 0,05).
Rasprava
U ovom su istraživanju protutijela za T. gondii utvrđena u 13 % svinja i na 17 % farmi. Ti rezultati odgovaraju pojedinim provedenim istraživanjima u Europi (Dubey i sur. 2009.; Villari i sur., 2009.; Foroutan i sur., 2019.). Iako bi uzgoj svinja u zatvorenim objektima trebao znatno pridonijeti smanjenju invazije svinja s T. gondii (Dubey i sur., 2009.), dokazana veća seroprevalencija na seoskim domaćinstvima u ovom istraživanju, koja većinom uzgajaju svinje u zatvorenim objektima bez ispusta, može se povezati s prisutnošću mačaka i glodavaca te neadekvatnom deratizacijom (Kijlstra i sur., 2008.; Villari i sur., 2009.). Prema ovom istraživanju svinje su sa svakog trećeg seoskog domaćinstva seropozitivne. Većina je pozitivnih uzoraka potjecala s farmi kategorije biosigurnosti 2, što znači da mjere biosigurnosti ne ispunjavaju uvjete u potpunosti na tim farmama, te bi trebalo razmotriti prikladnu reklasifikaciju kategorije biosigurnosti dodijeljene tim istim farmama (Kiš i sur., 2021.a). Iako je seroprevalencija T. gondii općenito bila niska, na nekim je farmama pronađena 100 %-tna seroprevalencija. Serološki bi nadzor u ovom slučaju omogućio identifikaciju farmi na kojima bi trebalo uvesti i unaprijediti postojeće biosigurnosne mjere. Veterinari bi te farme trebali posjećivati i savjetovati kako poboljšati biosigurnosne mjere, smanjiti rizik i povećati sigurnost mesa za potrošače. Trupove svinja s tako rizičnih objekata treba zamrznuti ili podvrgnuti toplinskoj obradi (Felin i sur., 2019.).
Zaključno, rezultati serološkog testiranja mesnog soka svinja mogu se preporučiti kao epidemiološki indikatori u okviru podataka o lancu prehrane koji prate pošiljku životinja u klaonicu. Serološka pretraga mesnog soka brza je, jednostavna i lako izvediva metoda te moguć alat u upravljanju rizikom od ove zoonoze. Pritom nije primjenjiva ni isplativa u testiranju svake pojedine životinje upućene na klanje, već u kategorizaciji rizičnosti farmi na reprezentativnom uzorku. No serološko profiliranje farmi samo po sebi ne može biti jednostavno rješenje za donošenje odluka u upravljanju rizikom, ako procjena isključuje sve druge čimbenike rizika koji mogu biti odgovorni za pojavu uzročnika na farmi.
Zahvala
Napomena
Literatura [… prikaži]
