Marina Prišlin Šimac*, Valentina Kunić, Vjekoslava Kostanić, Relja Beck, Daria Jurković Žilić, Sanja Duvnjak, Irena Reil, Ivana Lojkić, Dragan Brnić
Hrvatski veterinarski institut, Savska cesta 143, Zagreb, Hrvatska
Izlaganje sa Međunarodnog znanstvenostručnog skupa
Izvor: Zbornik radova 7. Hrvatski veterinarski kongres, Srebreno, 2024.
Sažetak
E ksperimentalna primjena mezenhimskih matičnih stanica porijeklom iz masnog tkiva pasa (cAD-MSC) pokazala je izvrsne rezultate u liječenju dosad neizlječivih ili teško izlječivih patologija. Potencijal ove terapije uspješno je testiran za mnoga ortopedska, neurološka, dermatološka, oftalmološka, gastroenterološka i hematološka stanja. Međutim, tijekom proizvodnje cAD-MSC pripravaka za terapijsku primjenu, nužno je in vitro izdvajanje i umnažanje stanica, što uvodi rizik mikrobiološke kontaminacije. Istraživanja su pokazala kako pohranjeni pripravci MSC-ova mogu biti kontaminirani bakterijama, gljivicama ili virusima u čak do 40% uzoraka. Posljedice infekcije cAD-MSCs mogu uključivati staničnu transformaciju, smrt ili perzistentnu infekciju, što u konačnici može rezultirati izostankom pozitivnog terapijskog ishoda i/ili prijenosom zaraznih bolesti. Uzevši u obzir smjernice Europske agencije za lijekove (engl. European Medicines Agency; EMA) koje navode testiranje sterilnosti pripravaka kao obavezan korak u proizvodnji, cilj ovog istraživanja bio je testirati banku cAD-MSC Hrvatskog veterinarskog insituta na prisutnost kontaminacije najznačajnijim patogenima kod pasa. Izdvojena je DNA i RNA iz 32 pripravka cAD-MSC te je nadalje korištena u optimiziranim molekularnim metodama lančane reakcije polimerazom (PCR) za procjenu kontaminacije patogenima. Panel patogena uključivao je pseći herpesvirus (Varicellovirus canidalpha1), parvovirus (Carnivore protoparvovirus 1), koronavirus (Alphacoronavirus 1), virus štenećaka (Morbillivirus canis), Rotavirus A, Leptospira spp., Brucella canis, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma spp. (hemotropne) i Neospora caninum. Primjenom navedenih metoda nije utvrđena prisutnost odsječaka genoma prethodno navedenih patogena, odnosno nije utvrđena mikrobna kontaminacija pripravaka cAD-MSC. Unatoč tome, mogućnost kontaminacije uvijek postoji te iako se bakterije i gljivice mogu učinkovito ukloniti primjenom antibiotika i antimikotika, potencijalne virusne kontaminacije ostaju izazov. Stoga je primjena Dobre laboratorijske prakse (engl. Good Laboratory Practice, GLP), uz strogo provođenje kontrole sterilnosti tijekom procesa izdvajanja i umnažanja stanica, nužna kako bi se osigurala sterilnost pripravaka cAD-MSC i sigurnost stanične terapije kod pasa.
Ključne riječi: mezenhimske matične stanice iz masnog tkiva; regenerativna veterinarska medicina; stanična terapija; pas; mikrobiološka kontaminacija
Zahvaljujemo Hrvatskoj zakladi za znanost na potpori u pripremi ovog istraživačkog članka u okviru uspostavnog istraživačkog projekta (UIP-2019-04-2178) „Istraživanje transkriptoma i sekretoma mezenhimskih matičnih stanica” – SECRET.
Marina Prišlin Šimac*, Valentina Kunić, Vjekoslava Kostanić, Relja Beck, Daria Jurković Žilić, Sanja Duvnjak, Irena Reil, Ivana Lojkić, Dragan Brnić
ASSESSMENT OF PATHOGEN CONTAMINATION IN MESENCHYMAL STEM CELL PREPARATIONS DERIVED FROM CANINE ADIPOSE TISSUE
Abstract
T he experimental application of adipose-derived mesenchymal stem cells in dogs (cAD-MSCs) has shown excellent results in the treatment of previously untreatable or difficult-to-treat diseases.
The potential of this therapy has been successfully tested for various orthopaedic, neurological, dermatological, ophthalmological, gastroenterological and haematological diseases. However, the production of cAD-MSCs for therapeutic use requires in vitro isolation and cell expansion, which entails the risk of microbiological contamination. Studies have shown that up to 40 % of stored MSC preparations can be contaminated with bacteria, fungi or viruses. The consequences of cell culture contamination can be cell transformation, cell death or persistent infection, which can ultimately lead to the failure to achieve a positive therapeutic result and/or therapy-induced pathogen transmission. Considering the guidelines of the European Medicines Agency (EMA), which state that sterility testing of products is a mandatory step in the manufacturing process, this study aimed to test the cAD-MSC bank of the Croatian Veterinary Institute for contamination with the most important pathogens in dogs. For the contamination assessment, DNA and RNA were extracted from 32 cAD-MSC preparations and analysed using validated molecular polymerase chain reaction (PCR) methods to assess pathogen contamination. The pathogen screening panel included canine herpesvirus (Varicellovirus canidalpha1), parvovirus (Carnivore protoparvovirus 1), coronavirus (Alphacoronavirus 1), distemper virus, Rotavirus A, Leptospira spp, Brucella canis, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma spp, Ehrlichia spp, Mycoplasma spp (haemotropic) and Neospora caninum. No genomes of the above pathogens were detected when screening the samples, indicating that the cAD-MSC preparations are not microbially contaminated. However, the potential for contamination always exists, and while bacterial and fungal contamination can be effectively controlled with antibiotics and antifungals, the containment of potential viral contamination remains a challenge. Therefore, the application of Good Laboratory Practise (GLP) and the strict enforcement of sterility control during the isolation and expansion process are essential to ensure the sterility of cAD-MSC preparations and the safety of cell therapy in dogs.
Key words: adipose-derived mesenchymal stem cells; regenerative veterinary medicine; cell therapy; dog; microbial contamination
We acknowledge the support of the Croatian Science Foundation in the preparation of this research article, provided through funding under the Installation Research Project (UIP-2019-04-2178) “Revealing the Transcriptome and Secretome of Mesenchymal Stem Cells” – SECRET.
