Besi Roić, I. Sučec, Ivana Lohman Janković, M. Zoretić, Ž. Cvetnić, V. Starešina, Z. Milas i N. Turk
Dr. sc. Besi ROIĆ, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, dr. sc. Željko CVETNIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, izvanredni profesor, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb; Ivica SUČEC, dr. vet. med., Ivana LOHMAN JANKOVIĆ, dr. med. vet., Ministarstvo poljoprivrede – Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane, Zagreb; Marin ZORETIĆ, dr. med. vet.; dr. sc. Vilim STAREŠINA, dr. med. vet., izvanredni profesor, dr. sc. Zoran MILAS, dr. med. vet., redoviti profesor, dr. sc. Nenad TURK, dr. med. vet., redoviti profesor, Veterinarski fakultet, Zagreb.
Uvod
Enzootska leukoza goveda (ELG) je zarazna proliferativna bolest dokazana u mnogim zemljama na svim kontinentima (Burny i sur., 1990.). Uzročnik je onkogeni retrovirus koji pripada rodu Deltaretrovirus, potporodici Orthoretrovirinae.
Virus je sferična oblika, veličine 90-120 nm, a virusne čestice sadrže dvije molekule jednostruke RNK, nukleoprotein p12, unutarnji protein kapside p24, transmembranozni glikoprotein gp30, glikoprotein virusne ovojnice gp51 i nekoliko enzima uključujući reverznu transkriptazu (Gillet i sur., 2007.). Proviralna DNK, nastala nakon reverzne transkripcije viralnog genoma, mora se ugraditi u DNK stanične jezgre domaćina gdje je tijekom dugog perioda latencije prisutna, a da pritom ne prouzroči umnažanje viralnog progena (Beyer i sur., 2002.).
Leukoza je kronična bolest s izrazito dugom inkubacijom koja može trajati od 200 dana pa sve do 7 godina, a mogu se zaraziti goveda svih dobnih kategorija (Cvetnić, 1997.). Većina zaraženih životinja, njih oko 70%, su nosioci virusa bez vidljivih znakova bolesti (latentno inficirane životinje), a oko 30% zaraženih grla preko 3 godine starosti razvije perzistentnu limfocitozu (Ferrer, 1979.).
Bolest se vrlo rijetko javlja u klinički uočljivom obliku i to u manje od 5-10% inficiranih životinja, u prosječnoj dobi od 4-5 godina (Trainin and Brenner, 2005.). Bolest nanosi velike gospodarske gubitke, a nastale štete se očituju u smanjenoj proizvodnji mlijeka (i do 50%), odbacivanju trupova s tumoroznim tvorbama na liniji klanja, čestog steriliteta ili otežanog koncipiranja te u troškovima nastalim izlučivanjem pozitivnih goveda u sklopu provedbe mjera suzbijanja i iskorjenjivanja bolesti (Woo i sur., 1989., Da i sur., 1993.).
Bolest se prenosi vertikalno i horizontalno.
Pod vertikalnim se prijenosom podrazumijeva intrauterini prijenos uzročnika s inficirane krave izravno na potomstvo i javlja se u oko 5% zaraženih životinja (Gonzales i sur., 2007).
Horizontalno prenošenje uzročnika u stadu ima presudno značenje, bilo da se radi o izravnom prijenosu sa životinje na životinju ili uz čovjekovu pomoć, različitim veterinarskim zahvatima na životinjama.
Enzootska leukoza goveda je bolest koja se ne liječi i u pravilu je svako pa i nespecifično liječenje zabranjeno. Jedini način suzbijanja ove bolesti jest rano otkrivanje zaraženih životinja i njihovo brzo uklanjanje iz uzgoja. Programi suzbijanja bolesti temelje se na sustavnom serološkom pretraživanju stada na prisutnost protutijela za virus ELG i uklanjanju svih pozitivnih grla iz uzgoja prije izbijanja kliničkih znakova bolesti (Lojkić i sur., 2000.).
U krvnom se serumu zaražene životinje protutijela mogu dokazati najranije 8-15 dana poslije infekcije, a u mlijeku 2-3 tjedna nakon pojave u krvi (Lugović i sur., 1989.). Dokaz specifičnih protutijela za glikoprotein gp51 i unutarnji protein p24 virusa ELG u serumu životinje pouzdan je znak da je životinja latentno inficirana (Van der Maaten i Miller, 1990.), a stvorena protutijela za VELG (virus enzootske leukoze goveda) u organizmu inficirane životinje perzistiraju doživotno.
U ovom radu prikazani su rezultati proširenosti ELG po županijama i farmama mliječnih goveda te obiteljskih gospodarstava u periodu od 2009. do 2010. godine s ciljem kako bi upotpunili spoznaje o pojavnosti bolesti u uzgojima goveda u Republici Hrvatskoj.
Materijal i metode
Serološko istraživanje
Uzorci krvnih seruma i mlijeka dostavljani su u laboratorij u skladu s godišnjom Naredbom o mjerama zaštite životinja od zaraznih i nametničkih bolesti i njihovom financiranju (NN 41/07, 7/10). Pretražena goveda potjecala su većim dijelom s farmi mliječnih goveda i obiteljskih gospodarstava tzv. “privatni sektor”, dok je manji broj uzoraka bio podrijetlom od uvezenih goveda iz karantenskog smještaja. Tijekom kontrole bolesti u razdoblju od 2009. godine do 2010. godine u Laboratoriju za serološku dijagnostiku virusnih bolesti Hrvatskog veterinarskog instituta Zagreb pretraženo je ukupno 116 220 uzoraka krvi i mlijeka goveda na prisutnost protutijela za virus enzootske leukoze goveda.
Uzorci krvi dostavljani su u epruvetama bez antikoagulansa.
Krvni serumi su potom centrifugirani u laboratorijskoj centrifugi 10 minuta na 1900 rpm kako bi se odvojio serum potreban za pretragu. Dobiveni su serumi do završetka pretraga pohranjeni u hladnjak na +4 °C ili kroz dulje razdoblje u zamrzivač na -20 °C.
Mlijeko je uzeto izmuzivanjem iz jedne četvrti i to prije redovite mužnje ili kao skupni uzorak od više krava. Uzorci mlijeka su centrifugirani pri 2000 rpm tijekom 15 minuta da bi se odvojio lipidni sloj ispod kojeg se pipetira uzorak za analizu.
Krv je za pretragu metodom lančane reakcije polimerazom (PCR) uzimana iz venae jugularis s antikoagulansom.
Tijekom 2009. godine metodom lančane reakcije polimerazom (PCR) za dokaz provirusne DNK pretraženo je 50 uzoraka pune krvi goveda.
Serološke metode
U serološkoj smo dijagnostici enzootske leukoze u goveda koristili imunoenzimne testove (ELISA) za dokazivanje protutijela za virus ELG u serumu i/ili mlijeku (Screening i Confirmation). Metode su propisane od strane Međunarodnog ureda za epizootije (OIE, 2008.). Koristili smo tzv. “probirne” imunoenzimne testove (SVANOVIR BLV gp51-Ab-screening format, Svanova, Biotech Ab, Uppsala, Švedska), a ukoliko je uzorak bio pozitivan pretražen je i potvrdnim testom s većom osjetljivošću (SVANOVIR BLV gp51-Ab, confirmation format, Svanova Biotech AB, Uppsala, Švedska). To su komercijalno dostupni neizravni imunoenzimatski kompleti koji omogućavaju brzu, osjetljivu i specifičnu metodu dokazivanja protutijela za glikoprotein gp51 virusa enzootske leukoze goveda u serumu i/ili mlijeku goveda.
Monoklonsko protutijelo za glikoprotein gp51 virusa enzootske leukoze goveda vezano je na stijenke polistirenske mikrotitracijske plitice s 96 (12×8) jažica. Nakon unosa ispitivanih uzoraka seruma i/ili mlijeka u jažicu, specifična protutijela za VELG, ako su prisutna u ispitivanom uzorku vezat će se na virusni antigen adsorbiran na stijenci. Nakon inkubacije i višekratnog ispiranja dokazuje se prisutnost goveđih imunoglobulina kromogenom kojeg čine monoklonska protutijela za goveđe imunoglobuline obilježena peroksidazom hrena (Mab anti-bovine IgG-HRPO).
Optička gustoća uzoraka mjeri se spektrofotometrom primjenom filtra od 450 nm, a dobiveni se rezultati prosuđuju prema uputama proizvođača. Rezultati su očitavani na spektrofotometru „Tecan Sunrise Basic“, Austrija.
Molekularne pretrage
Metoda lančane reakcije polimerazom – PCR
Izolacija DNK iz uzoraka pune krvi goveda i „nested“ PCR Iz 300 μL pune krvi izdvojena je DNK koristeći automatizirani sustav za izdvajanje nukleinskih kiselina iPrep “Purification Instrument Platform” (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) te pripadajuće „patrone“ za izolaciju DNK iz krvi (iPrep PureLink gDNA Blood) prema uputama proizvođača.
Odsječak env (envelope) gena virusa ELG veličine 444 bp umnožili smo metodom ugniježđenog („nested“) PCR u ukupnom volumenu od 25 μL koristeći JumpStart REDTaq Ready Mix (Sigma-Aldrich, Steinheim, Njemačka). U prvom krugu reakcije rabili smo početnice: 5’- TCT GTG CCA AGT CTC CCA GAT A i 5’-AAC AAC AAC CTC TGG GAA GGG T (Beier i sur., 1998.), a umnoženi odsječak iznosio je 598 bp. U drugom krugu reakcije („nested”) koristili smo 3 μL PCR produkta iz prvog kruga i sljedeće početnice: 5’-CCC ACA AGG GCG GCG CCG GTT T i 5’-GCG AGG CCG GGT CCA GAG CTG G (Beier i sur., 2001.). Obje reakcije umnožavanja izvedene su u aparatu GenAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). Umnožene smo odsječke env gena veličine 444 bp analizirali nakon elektroforeze u 2 %-tnom gelu agaroze obojanim etidij bromidom.
Rezultati
U razdoblju od 2009. godine do 2010. godine pretraženo je 116 220 uzoraka krvnih i mliječnih seruma goveda, a protutijela za virus ELG utvrđena su u 809 uzoraka (0,076%). Tijekom 2009. godine pretraženo je 92 602 uzoraka od kojih je pozitivne serološke reakcije pokazalo 666 uzoraka (0,71%). Od ukupnog broja uzoraka pretraženo je 61 627 krvih seruma s 634 (1,02%) pozitivnih uzoraka te 30 975 mlijeka s 32 (0,10%) pozitivna uzorka u kojima su utvrđena protutijela za VELG. S 58 mliječnih farmi u RH pretraženo je 18 797 uzoraka krvi od kojih je 583 (3,10%) grla dalo pozitivnu reakciju, a u 245 pretražena mliječna seruma u njih 32 (13,06%) dokazana su protutijela za VELG (Tabela 1.). Najveći broj serološki pozitivnih reakcija utvrđen je u Zadarskoj županiji u 300 uzoraka (7,59%). Potom slijedi Osječko-baranjska županija s 230 (1,20%) pozitivnih uzoraka te Vukovarsko-srijemska sa 101 pozitivnih uzoraka (1,32%) (Tabela 2.) Od 73560 pretraženih uzoraka podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava u njih 51 (0,06%) dokazane su pozitivne reakcije.
Tijekom 2010. godine pretraženo je ukupno 23 618 uzoraka krvi i mlijeka, a pozitivne reakcije utvrđene su u 143 (0,60%) uzorka krvnog seruma.
Pretraženo je 13 058 krvnih seruma sa 41 farme mliječnih goveda od kojih su 100 (0,76%) bila pozitivna, a u 74 pretražena mliječna seruma nisu utvrđena protutijela za VELG (Tabela 3.). Najveći broj pozitivnih uzoraka ponovo je bio u Zadarskoj županiji (2,60%), a slijede ju Vukovarsko-srijemska (0,96%) te Osječko-baranjska županija s 0,71% (Tabela 4.). Od pretraženih 10 486 uzoraka s obiteljskih gospodarstava u 43 (0,41%) krvna uzorka utvrđena su protutijela za VELG.
Protutijela za virus ELG nisu dokazana ni u jedne životinje u karantenskom smještaju.
Iz rezultata pretraživanja vidljivo je da je tijekom kontrole bolesti u razdoblju od 2009. godine do 2010. godine ukupno dokazano 809 leukoznih goveda. Pretraženo je 32 174 uzoraka krvi i mlijeka podrijetlom s mliječnih farmi i ELG je utvrđena u 715 (2,22%) životinja, dok je od 84 046 pretraženih uzoraka krvi i mlijeka podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava u njih 94 (0,11%) dokazana su protutijela za VELG.
Nakon dokaza protutijela za virus ELG imunoenzimnim testovima provedeno je i dokazivanje provirusne DNK metodom „nested“ PCR. Nakon dva kruga reakcije umnožavanja, u slučaju pozitivne reakcije, veličina dobivenih PCR produkata iznosila je 444bp, što je vidljivo na 2%-tnom gelu agaroze (Slika 1.). Primjenom ove metode, tijekom 2009. godine od ukupno 50 pretražena uzorka pune krvi goveda, koji su prethodno imunoenzimnim testovima dali pozitivne reakcije, u njih 39 (78%) dokazana je prisutnost dijela genoma VELG.
Rasprava
Unatoč primjeni strogih mjera kontrole, infekcija virusom enzootske leukoze goveda i dalje se sporadički javlja na većini kontinenata (Kurtinaitiene i sur., 2008.), a dokazana je i u nekim europskim zemljama kao što su: Italija, Portugal, Litva, Estonija i dr. (Polet, 2004.).
Uslijed znatnih ekonomskih gubitaka što ih uzrokuje u govedarstvu, ELG i danas predstavlja veliki gospodarski problem.
Enzootska leukoza je bolest koja sukladno nacionalnom zakonodavstvu Republike Hrvatske te obvezama proizašlim iz članstva u OIE podliježe obveznoj prijavi. Iskorjenjivanje ELG u Republici Hrvatskoj određeno je Pravilnikom o mjerama za suzbijanje i iskorjenjivanje enzootske leukoze goveda (NN 30/2006). Zahvaljujući brzim i sigurnim postupcima pretraživanja suzbijanje ELG se svodi na rano otkrivanje i brzo uklanjanje inficiranih goveda. Stoga serološke metode pretraživanja moraju biti pouzdane, specifične i osjetljive kako bi se što ranije otkrila inficirana grla, čak i sa minimalnom razinom protutijela.
S obzirom na razvoj novih dijagnostičkih metoda AGID test je u laboratorijskoj dijagnostici ELG izgubio na svojoj važnosti te se je sredinom 2008. godine u potpunosti prestao rabiti u HVI Zagreb. Imunoenzimnim testovima (ELISA) koje danas primjenjujemo u laboratoriju, moguće je dokazati protutijela za virus ELG kako u pojedinačnom tako i u skupnom uzorku seruma i/ili mlijeka (Mammerickx i sur., 1985.). Imunoenzimni test je metoda odabira pri pretraživanju velikog broja uzoraka kako u tzv. “screening” programima tako i za potvrdu ELG.
ELISA testovi su se pokazali i ekonomski vrlo prihvatljivim, jer se zbog sve brojnijih uzgoja i proizvodnje mliječnih goveda te uvoza rasplodnih životinja godišnje pretražujemo desetke tisuća uzoraka na prisutnost protutijela za virus enzootske leukoze goveda. Zahvaljujući mogućnosti uporabe mlijeka kao dijagnostičkog uzorka, pretpostavka je da se veći dio populacije mliječnih goveda obuhvati pretraživanjima. To je od velike praktične važnosti kako zbog smanjenja stresnih situacija za životinju tako i zbog jatrogenog širenja zaraze. Metoda je osjetljiva, specifična i pouzdana, a za njeno izvođenje potrebno je 4-5 sati. Uporaba potvrdnih ELISA testova tzv. “komfirmativnih” preporuča se u slučajevima pozitivnih nalaza u “probirnoj” metodi kako bi se donijela pravovaljana dijagnoza.
Aktivnu infekciju moguće je dokazati metodom lančane reakcije polimerazom (PCR) koja je specifična za izravnu dijagnostiku infekcije perifernih limfocita u krvi virusom ELG (Klintevall i sur., 1994.). Od 2008. godine se Odjelu za virologiju lančana reakcija polimerazom koristi za dijagnosticiranje ELG. Metoda lančane reakcije polimerazom rabi se ponajviše kao potvrdna metoda kako zbog složenosti izvedbe i uvjeta koji su potrebni pri izvođenju pretrage tako i zbog razmjerne skupoće. Metoda PCR se ne koristi za rutinsku dijagnostiku i iskorjenjivanje ELG.
Tijekom ovog istraživanja provedenog u razdoblju od 2009. godine do 2010. godine temeljem viroloških pretraga vidljivo je da je enzootska leukoza goveda prisutna u Republici Hrvatskoj, kako u privatnim obiteljskim gospodarstvima tako i na mliječnim govedarskim farmama. Od pretraženih uzoraka krvi i mlijeka podrijetlom s mliječnih farmi ELG je utvrđena u 715 (2,22%) životinja, dok je u uzorcima podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava dokazana u 94 (0,11%) životinje. Najvećije broj serološki pozitivnih reakcija na leukozu u navedenom periodu zabilježen u Zadarskoj županiji (6,74%) te u Vukovarsko-srijemskoj (1,21%) i Osječko-baranjskoj županiji s 1,02%. Od ukupnog broja pretraženih životinja podrijetlom iz privatnih obiteljskih gospodarstava enzootska leukoza goveda utvrđena je u svega 0,11% životinja. Jedan od razloga tako niskom postotku bolestivjerojatno je i činjenica da se u privatnim obiteljskim gospodarstvima kontrola ne radi sustavno već ponajviše za potrebe kupoprodaje. S druge strane na velikim govedarskim farmama postoji stalna kontrola bolesti od strane organiziranih veterinarskih službi. Spoznaja da ni u jedne životinje u karantenskom smještaju nisu utvrđena protutijela za virus ELG upućuje na to kako virus cirkulira unutar domaćih uzgoja goveda pa osobitu pozornost valja posvetiti sustavnojkontroli rasplodnih životinja.
Na temelju iznesenih rezultata može se zaključiti da je enzootska leukoza goveda bolest čija je zastupljenost u uzgojima mliječnih goveda u Hrvatskoj između 2 i 3%. Stalna je kontrola uzgoja s obzirom na ELG i dalje potrebna u intenzivnim uzgojima mliječnih goveda, kao i izrada programa kontrole i suzbijanja koji bi osigurao ograničavanje širenja bolesti.
Sažetak
Tijekom istraživanja u razdoblju od 2009. godine do 2010. godine pretraženo je 116 220 uzoraka krvnih i mliječnih seruma goveda na prisutnost protutijela za virus enzootske leukoze goveda. Pretražena goveda potjecala su dijelom s farmi mliječnih goveda, a dijelom s obiteljskih gospodarstava u Republici Hrvatskoj, dok je manji broj uzoraka bio podrijetlom od uvezenih goveda iz karantenskog smještaja.
Ispitivani su uzorci pretraživani imunoenzimnim testovima (ELISA test probirni i potvrdni) i metodom lančane reakcije polimerazom (PCR). Protutijela za virus ELG utvrđena su u 2,22% grla koja su poticala s mliječnih farmi, u 0,11% životinja podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava, dok nisu dokazana ni u jedne životinje u karantenskom smještaju. Od ukupno 50 pretražena uzorka pune krvi metodom “nested” PCR u njih 39 (78%) dokazana je prisutnost dijela genoma VELG. Na temelju provedene kontrole ELG može se zaključiti da Hrvatska ima povoljnu situaciju s obzirom na pojavnost bolesti. Ekonomski gubici što ih prouzroči ELG u govedarskoj proizvodnji ima veliko gospodarsko značenje pa je kontrola bolesti i dalje neophodna.
Literatura [… prikaži]
Detection of bovine leukaemia virus specific antibodies in cattle in the Republic of Croatia from 2009 to 2010
Besi Roić, DVM, PhD, Scientific Advisor, Željko Cvetnić, DVM, PhD, Scientific Advisor, Associate Professor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Ivica SUČEC, DVM, Ivana LOHMAN JANKOVIĆ, DVM, Ministry of Agriculture – Veteerinary direcorate, Zagreb; Marin ZORETIĆ, DVM, Vilim Starešina, DVM, PhD, Accociate Professor, Zoran Milas, DVM, PhD, Full Professor, Nenad Turk, DVM, PhD, Full Professor, Faculty of Veterinary Medicine, Zagreb
A study was conducted to determine the prevalence of bovine leukaemia virus (BLV) in cattle in the Republic of Croatia. A total of 116,220 blood serum and milk samples were tested for the presence of BLV antibodies during the period 2009–2010. The tested samples originated from cattle from dairy farms and family farms, while a smaller number of samples were from imported cattle. BLV antibodies were detected in 2.22% of cattle from dairy farms and in 0.11% of cattle from family farms.
A total of 50 blood samples were tested by PCR and 39 (78%) of the samples showed positive results. All sera tested in quarantine were negative for BLV antibodies. BLV infection is an “economic” disease that causes significant losses in cattle management and disease control and eradication programs are recommended.
