Vanesa Ivetić Tkalčević i Miroslava Dominis Kramarić
Dr. sc. Vanesa Ivetić Tkalčević, dr. med. vet., mr. sc. Miroslava Dominis Kramarić, dr. med. vet., Zagreb
UvodMakrolidni antibiotici (makrolidi)Farmakokinetska svojstva i farmakovigilancijaProtuupalni in vitro učinci makrolidnih antibiotikaProtuupalno djelovanje u in vivo modelu ovalbuminom izazvane eozinofilijeProtuupalno djelovanje u in vivo modelu neutrofilijeImunomodulacijski učinci makrolidnih antibiotikaZaključakSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
M akrolidni antibiotici (makrolidi) su kemijski heterogena skupina spojeva s protubakterijskim učinkom. Prvi makrolidni antibiotik, eritromicin, izoliran je kao produkt fermentacije kulture Saccharopolyspora erythrea.
Protubakterijski učinak makrolida temelji se na sprječavanju sinteze proteina.
Eritromicin se veže na 50S podjedinicu ribosoma evolucijski starijih ribosoma i organela kao što su mitohondriji i kloroplasti eukariotskih stanica, za V domenu 23S rRNK, blizu izlaznog kanala za peptidni lanac, ometajući pokretanje ishodišnog peptida. Primjenjuju se u liječenju infekcija gornjih i donjih dišnih puteva, blažih infekcija kože i mekih tkiva te spolno prenosivih bolesti izazvanih Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum i Chlamydia trachomatis.
Roksitromicin i azitromicin koriste se i u liječenju oportunističkih infekcija u pacijenata oboljelih od AIDS-a, izazvanih s Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum i Pneumocystis carinii (Schonfeld i Kirst, 2002.).
Pored protubakterijskih svojstava, makrolidi posjeduju i protuupalna i imunomodulacijska svojstva djelujući na imunosni sustav organizma.
Njihova protuupalna svojstva posljedica su nakupljanja u upalnim stanicama, posebice u polimorfonuklearnim stanicama, u koncentracijama i do nekoliko stotina puta većim od onih u međustaničnoj tekućini (Labro, 2002.).
Mehanizam unutarstaničnog nakupljanja makrolida nije u potpunosti razjašnjen.
Jedna od teorija zasniva se na pretpostavci da se radi o aktivnom procesu posredovanom proteinima. Citokini in vitro potiču nakupljanje makrolida u makrofagima pa na mjestu upale stanice nakupljaju znatno veću koncentraciju makrolida nego u fiziološkim uvjetima (Čulić i sur., 2001.).
Namjera ovog preglednog rada bila je prikazati protuupalna i imunomodulacijska svojstva makrolidnih antibiotika (makrolida) u in vitro i in vivo sustavima.
Makrolidni antibiotici (makrolidi)
Struktura i podjela
eritromicina A i njegovih derivata.
Ovisno o veličini laktonskog prstena makrolidi se dijele u nekoliko skupina (Slika 2).
Karakteristika prirodnih makrolida je prisustvo 12-, 14- ili 16 atoma u makrocikličkom laktonskom prstenu, na kojeg se može vezati nekoliko amino šećera. U kliničkoj praksi najučinkovitijim su se pokazali 14- i 16-člani makrolidi. Oleandomicin i eritromicin A predstavnici su prirodnih 14-članih makrolida, dok 16-članu skupinu predstavljaju linkomicin, josamicin, spiromicin i midekamicin.
12-člani makrolidi, poput metimicina, nemaju značajniju primjenu u liječenju bolesti. Azitromicin, kao predstavnik 15-članih azalida, nastao je iz eritromicina A umetanjem dušika u aglikonski prsten na koji je potom vezana metilna skupina (Schonfeld i Kirst, 2002.).
Farmakokinetska svojstva i farmakovigilancija
Makrolide odlikuje dobar učinak nakon per os (p.o.) primjene te relativno visoka razina sigurnosti, čak i nakon uzimanja visokih doza supstancije.
Bioraspoloživost prirodnih makrolida nakon p.o. primjene ovisi o prisutnosti hrane u probavnom sustavu, te o primijenjenoj formulaciji.
Također, prirodni makrolidi, poput eritromicina, u kiselom se mediju brzo razgrađuje u neaktivne metabolite. Nasuprot tome, derivati eritromicina, poput azitromicina i klaritromicina, znatno su stabilniji u kiselom mediju te se dobro resorbiraju nakon p.o. unosa (McKenna i Evans, 2001.). Volumen raspodjele azitromicina i klaritromicina u organizmu znatno je veći od volumena raspodjele eritromicina. Za razliku od azitromicina koji se odlikuje naglašenom raspodjelom po tkivima u koncentracijama koje su 10-100 puta veće od koncentracija u plazmi, eritromicin se u tkivima nakuplja u koncentraciji svega 0,5-5 puta većoj u odnosu na plazmu.
Klaritromicin se, naprotiv, po unosu u visokim koncentracijama nakuplja u serumu. Po p.o. unosu doze od 500 mg u ljudi, vrijeme poluživota eritromicina iznosi 2 sata, klaritromicina 4 sata, a azitromicina 68 sati.
Iako se eritromicin smatra jednim od sigurnijih antibiotika za uporabu, uočeno je da ponekad izaziva probavne smetnje ovisno o visini primijenjene doze (McKenna i Evans, 2001.). Eritromicin, u odnosu na klaritromicin i azitromicin, pokazuje znatno veći afinitet prema motilinskim receptorima probavnog sustava, zbog čega češće dolazi do probavnih smetnji u vidu mučnine, proljeva, bolova u trbuhu te povraćanja. Pojava flebitisa nakon parenteralne primjene znatno je češća kod eritromicina nego kod azitromicina.
Glavobolja, poremećaji funkcije jetre, kožni osip te ototoksičnost javljaju se u manje od 2% slučajeva.
Protuupalni in vitro učinci makrolidnih antibiotika
Utjecaj na adheziju leukocita
Prijanjanje leukocita za krvnu žilu potiče se djelovanjem adhezijskih molekula (selektini i integrini) koje aktiviraju lokalno oslobođeni upalni citokini. Eritromicin umanjuje ekspresiju CD11b/CD18 integrina u neutrofila stimuliranih lipopolisaharidom (LPS), spriječavajući njihovo prijanjanje (Lin i sur., 2000.). U istom je pokusu eritromicin inhibirao oksidativni stres i otpuštanje interleukina (IL)-8 iz stimuliranih granulocita. Khair i sur. (1995.) pokazali su utjecaj eritromicina na inhibiciju otpuštanja IL-6, IL-8 i sICAM-1 (engl. soluble intercellular adhesion molecule-1) u staničnim kulturama tretiranim LPS-om. Okubo (1997.) je utvrdio da tretman eritromicinom i midekamicinom, za razliku od roksitromicina, u trajanju od jednog do tri sata značajno smanjuje ekspresiju MAC-1 na površini neutrofila.
Izlaganje stanica roksitromicinu kroz duže vremensko razdoblje, dovodi do smanjenja ekspresije MAC-1 u neutrofilima pacijenata oboljelih od difuznog panbronhiolitisa (DPB) (Kusano i sur., 1995.). Klaritromicin je u stanicama sinovije umanjio ekspresiju ICAM-1, LFA-3 (engl. lymphocyte function-associated antigen-3) i VCAM-1 (engl. vascular cell adhesion molecule-1) te IL-1β, IL-6, IL-8, čimbenika stimulacije rasta kolonija granulocita (G-CSF) (engl. granulocytecolony stimulating factor) i čimbenika stimulacije rasta kolonija granulocita i makrofaga (GM-CSF) (engl. granulocyte macrophage – colony stimulating factor) (Matsuoka i sur., 1996.).
Utjecaj na kemotaksiju upalnih stanica
Velik broj upalnih medijatora potiče kemokinezu ili neusmjereno kretanje upalnih stanica, dok je relativno mali broj medijatora (leukotrieni (LT)B 4 , faktor komplementa 5a, IL-8, sFas) koji aktiviraju kemotaksiju ili usmjereno gibanje neutrofila na mjesto upale. Tamaoki i sur. (1994.) uočili su da se nakon izlaganja neutrofila mediju s eritromicinom ili roksitromicinom značajno smanjuje kemotaksija neutrofila i njihova adhezija za endotelne stanice stimulirane endotoksinom. Osim toga, eritromicin, josamicin, miokamicin, roksitromicin i rokitamicin umanjili su proces kemotaksije neutrofila in vitro i ex vivo u stanicama dobrovoljaca tretiranih navedenim antibioticima (Torre i sur., 1991.).
Utjecaj na oslobađanje citokina i kemokina
Stanice imunološkog sustava međusobno komuniciraju putem međustaničnih signalnih polipeptida – citokina. Utjecaj makrolida na oslobađanje protuupalnih citokina je promjenjiv (Čulić i sur., 2001). Klaritromicin i azitromicin spriječili su oslobađanje IL-1α, IL-6 i tumor nekrotizirajućeg faktora (TNF)-α u humanim monocitima. Nasuprot tomu, u drugom su pokusu eritromicin i spiramicin potaknuli oslobađanje IL-6 u humanim monocitima. Klaritromicinom potaknuto oslobađanje IL-6 uočeno je i u kulturi stanica adenokarcinoma mliječne žlijezde 13762NF.
Na razini RNK, eritromicin i klaritromicin su umanjili ekspresiju mRNK i oslobađanje IL-6 iz epitelnih stanica bronha.
Puno su jasniji učinci makrolida na upalne citokine i kemokine. Takeshita i sur. (1989.) pokazali su da klaritromicin u odnosu na eritromicin u većoj mjeri koči sintezu IL-1 u makrofagima, a sličan učinak uočen je kod spiramicina i diritromicina, kao posljedica smanjenja koncentracije protein kinaze C (Moutard i sur., 1999.).
U ex vivo studiji provedenoj na punoj krvi dobrovoljaca eritromicin je značajno umanjio oslobađanje IL-8, ENA-78 (engl. epithelial cell-derived neutrophil attractant-78) i makrofagnog upalnog proteina (MIP)-1 (engl. macrophage-inflammatory protein-1) (Schultz i sur., 2000.). U staničnoj kulturi fibroblasta, podrijetlom iz ljudskih pluća, stimuliranoj TNF-α-om i interferonom (IFN)-γ, eritromicin je značajno umanjio oslobađanje eozinofilnih kemotaksijskih peptida kao što su RANTES (engl. regulated upon activation, normal T expressed and presumably secreted), eotaksin, G-CSF i GM-CSF te time umanjio kemotaksijsku sposobnost fibroblasta za nakupljanje eozinofila (Sato i sur., 2001.). Nadalje, 14-člani makrolidi koče oslobađanje IL-8 iz eozinofila humanog podrijetla i kulture humanih epitelnih stanica nosa (Kohyama i sur., 1999.).
Utjecaj na degranulaciju polimorfonukleara i fagocitozu
Degranulacija neutrofilnih granula u fagolizosome ili izvanstanični medij je ključan trenutak za uklanjanje stranih mikroorganizama. Makrolidi izravno potiču degranulaciju humanih neutrofila (Abdelghaffar i sur., 1996.). Xu i sur. (1996.) utvrdili su da makrolidni antibiotici potiču kemotaksiju makrofaga, fagocitozu i uklanjanje Candida albicans.
Poticanjem obrambenih reakcija domaćina, makrolidi potpomažu svoje protubakterijsko djelovanje.
Utjecaj na slobodne kisikove radikale
U granulama zrelih neutrofila nalazi se velika količina oksidaze ovisne o nikotinamid dinukleatid fosfatu (NADPH) koja razgrađuje fagocitirane mikroorganizme. Kisikovi spojevi koje stvaraju NADPH oksidaza i ostali enzimi štetni su ne samo za bakterije, već i za okolno tkivo ukoliko nastaju u suvišku kroz duži vremenski period. Ovisno o trajanju tretmana i visini doze, 14- i 15-člani makrolidi umanjuju oksidativni stres neutrofila (Čulić i sur., 2001.). U stimuliranim granulocitima eritromicin je umanjio oksidativni stres i oslobađanje IL-8, a azitromicin fagocitozu Escherichia coli i oksidativni stres. Osim toga, azitromicin i klaritromicin su umanjili stvaranje kisika i kemotaksiju neutrofila, pokazavši se uspješnim u liječenju difuznog panbronhiolitisa, za razliku od roksitromicina koji nije bio djelotvoran.
Klindamicin, eritromicin i roksitromicin su, ovisno o visini doze umanjili stvaranje superoksida u stimuliranim i nestimuliranim neutrofilima.
Uloga NO, kojeg sintetizira endotelna NO sintaza (eNOS), je održavanje normalnih fizioloških procesa.
Inducibilne NO sintaze (iNOS), utječu na povećanu sintezu NO, posebno u upalnim stanicama. Bakterijske infekcije izazivaju porast koncentracije NO poticanjem aktivnosti NO sintaza u neutrofilima i makrofagima. NO koči valjanje i prihvaćanje leukocita za endotelne stanice (Hickey, 2001.). Eritromicin stimulira eNOS na sintezu NO putem mehanizma ovisnog o protein kinazi A. Također, eritromicin potiče ekspresiju NOS-a, a time i oslobađanje NO iz endotelnih stanica (Čulić i sur., 2001.). Suprotno tome, Tamaoki i sur. (1999.) uočili su da klaritromicin in vitro umanjuje ekspresiju iNOS-a i oslobađanje NO u alveolarnim makrofagima stimuliranim LPS-om i IFN-γ te da eritromicin, roksitromicin i josamicin smanjuju aktivnost iNOS-a u alveolarnim makrofagima i koncentraciju IL-1β i TNF-α. Eritromicin, klaritromicin i josamicin su umanjili ekspresiju iNOS mRNA i oslobađanje NO iz alveolarnih makrofaga (Kohri i sur., 2000.). Rezultati studije Sarne i sur. (2000.) pokazali su da eritromicin potiče oslobađanje NO iz sinaptičkih neurona vjerojatno utjecajem na neuralnu NO sintazu.
Utjecaj na apoptozu stanica
Apoptoza ili programirana smrt stanice jedan je od ključnih faktora u rješavanju patoloških procesa kronične upale (Čulić i sur., 2001.). Ciklus života neutrofila iznosi 6-7 sati, što znači da dnevno odumre mnoštvo neutrofila, posebice tijekom upale.
Apoptozom neutrofila slabe i funkcije oksidativnog stresa i degranulacije. Za razliku od nekrotičkih neutrofila čiji se sadržaj oslobađa u okolno tkivo oštećujući ga, apoptotičke neutrofile razgrađuju makrofagi. Oštećenja tkiva izazvana utjecajima granulocita i kronične upale, mogu biti i posljedica smanjene apoptoze.
Eritromicin potiče apoptozu neutrofila mehanizmom djelomično ovisnim o cikličkom adenozin-monofosfatu (cAMP), kao i roksitromicin, na izoliranim humanim neutrofilima.
Eritromicin djeluje proapoptotički i na izoliranim eozinofilima zamorca stimuliranih s IL-5.
Apoptozu je u nekoliko različitih staničnih linija potaknuo i 17-člani derivat tilozina.
Azitromicin izaziva apoptozu neutrofila, osim u prisustvu Streptococcus pneumoniae, čemu je vjerojatno uzrok utjecaj bakterije na navedeni proces. Također, azitromicin nije utjecao na oslobađanje IL-8, kao niti na oksidativni stres polimorfonuklearnih leukocita.
Proapoptotička aktivnost azitromicina i klaritromicina dokazana je metodom protočne citometrije u modelu pune krvi. Tilmikozin je potaknuo apoptozu perifernih neutrofila, nakon inkubacije u trajanju od dva sata. Za razliku od azitromicina, tilmikozin je ispoljio proapoptotičko djelovanje neovisno o prisutnosti bakterija (Pasteurella haemolytica) te potaknuo makrofage na fagocitozu neutrofila.
Protuupalno djelovanje u in vivo modelu ovalbuminom izazvane eozinofilije
U svrhu ispitivanja in vivo učinaka klaritromicina i josamicina na pojačanu aktivnost sluznice dišnih prohoda, Shimizu i sur. (2003.) izazvali su hipertrofične i metaplastične promjene stanica nosnog epitela intranazalnom (i.n.) primjenom ovalbumina (OVA) u štakora uz prethodnu senzibilizaciju s OVA. Za razliku od josamicina, p.o. predtretman klaritromicinom (5-10 mg/kg) tijekom 3 dana, umanjio je razinu hipertrofičnih i metaplastičnih promjena stanica, kao i izlučivanje sluzi. In vitro učinci klaritromicina i eritromicina na staničnoj kulturi NCI-H292 TNF-α potaknutoj i nepotaknutoj, očitovala se smanjenjem ekspresije mucina 5AC (MUC5AC) mRNA, upućujući na mogući mehanizam djelovanja 14-članih makrolida. Sarria i sur. (2004.) istraživali su djelotvornost eritromicinskog derivata Z104657A u modelu alergijske upale pluća izazvane s OVA u štakora.
Nakon jednotjednog predtretmana (40 μmoL/kg, p.o.), Z104657A je spriječio reakciju plućne preosjetljivosti prema 5-hidroksitreptaminu i nakupljanje eozinofila u plućima.
Davanje eritromicina (180 mg/kg, p.o.) tijekom 7 dana, u modelu OVA izazvane alergijske upale dišnih puteva u štakora, rezultiralo je smanjenjem ukupnog broja stanica i transkripcije NF-κB u plućima (He i sur., 2005.). Hrvačić i sur. (2009.) ispitivali su protuupalni učinak predtretmana klaritromicinom (200 mg/kg, intrapritonealno (i.p.)) u modelu astme izazvane s OVA i postigli smanjenje koncentracije IL-4, IL-5 i IL-13 te CCL-2 i CXCL-2 u bronhoalveolarnom ispirku (BAI) te nakupljanje eozinofila u plućima. Klaritromicin je, osim upalne reakcije, umanjio i preosjetljivost dišnih puteva. Tokuda i sur. (2010.) istražili su učinke eritromicina, azitromicina i josamicina na refleks kašlja izazvanog udisanjem kapsaicina u modelu OVA izazvane alergijske upale dišnog sustava u zamorčića. Višestruki i.p. tretman tijekom 4 uzastopna dana, 12 sati nakon provokacije antigenom, pokazao je da eritromicin (5-50 mg/kg/dan) i azitromicin (50 mg/kg/dan), za razliku od josamicina (50 mg/kg/dan) značajno smanjuju učestalost kašlja i ukupan broj stanica u BAI-u. Eritromicin je, u ovisnosti o visini doze, inhibirao porast koncentracije supstancije P, prostaglandina (PG)E 2 i LTB 4 u BAI-u, ali nije utjecao na razinu histamina u BAI-u te na aktivnost endopeptidaze u dušniku. Navedeni rezultati pokazuju da 14- i 15-člani makrolidi, za razliku od 16-članih, umanjuju refleks kašlja izazvan s OVA inhibirajući oslobađanje senzibilizatora aferentnih živaca.
Protuupalno djelovanje u in vivo modelu neutrofilije
Kako bi odredili utjecaj jednotjednog predtretmana eritromicinom (10 mg/kg, p.o.) na propusnost krvnih žila u dušniku i plućima te na nakupljanje neutrofila, Tamaoki i sur. (1995.) su u štakora izazvali akutnu upalu pluća intratrahealnim (i.t.) unosom LPS-a.
Eritromicin je umanjio propusnost krvnih žila u dušniku i plućima. Tamaoki i sur. (1996.) ispitivali su, pored eritromicina, utjecaj jednotjednog predtretmana roksitromicinom (1, 3, 5 i 10 mg/kg, p.o.) u modelu upale dušnika u zamorčića izazvane i.t. unosom IL-8 u obliku aerosola. Oba makrolida su u dozama od 5 i 10 mg/kg umanjila aktivnost sekretornih stanica i nakupljanje neutrofila u dušniku. U modelu upale pluća izazvane imunoglobulin (Ig)G imunološkim kompleksom (IgG-ICx) u štakora, predtretman eritromicinom i josamicinom (50 mg/kg, p.o.) umanjio je intraalveolarno nakupljanje neutrofila te koncentraciju NO u izdahnutom zraku, što je, vjerojatno, posljedica sprječavanja oslobađanja citokina i smanjene ekspresije iNOS mRNA alveolarnih makrofaga (Tamaoki i sur., 1999.).
Roksitromicin je umanjio oslobađanje IL-1β i TNF-α u LPS-om stimuliranoj kulturi humanih monocita. Također, u modelu LPS-om izazvane plućne neutrofilije u miševa predtretman roksitromicinom (2,5 mg/kg, p.o.) kroz 7 do 12 tjedana je umanjio koncentraciju IL-1β i TNF-α u plućima (Suzaki i sur., 1999.). Shimizu i sur. (2003.) pokazali su da trodnevni predtretman klaritromicinom (5-10 mg/kg, p.o.) umanjuje hipertrofične i metaplastične promjene u stanicama nosnog epitela prethodno podraženih LPS-om. U modelu plućne neutrofilije u miševa izazvane i.t. unosom kulture mrtve bakterije Pseudomonas aeruginosa, tretman klaritromicinom (50 mg/kg, i.p.) tijekom 5 dana, započetog 2 dana prije izazivanja neutrofilije, nije umanjio broj neutrofila, ali je povećao broj limfocita u BAI-u i tako potaknuo urođeni stanični odgovor i rezoluciju upale dišnog sustava (Pinto i sur., 2004.). Eritromicinski derivat Z104657A (40 μmol/kg, p.o.) je nakon jednotjednog predtretmana u životinjskom modelu plućne neutrofilije izazvane LPS-om u štakora umanjio nakupljanje neutrofila, koncentraciju MUC5AC i ekspresiju njegove mRNA u plućima (Sarria i sur., 2004.). Jednotjedni predtretman eritromicinom (30 mg/kg, p.o.) u modelu LPS-om izazvane plućne neutrofilije umanjio je broj neutrofila i aktivnost elastaze u BAI-u te aktivnost mijeloperoksidaze (MPO) u plućima, a nije imao utjecaja na smanjenje koncentracije TNF-α i MIP-2 u plućima. Navedeni učinak vjerojatno je posljedica utjecaja eritromicina na smanjenje ekspresije mRNA P-selektina, E-selektina, ICAM-1 i VCAM-1 u plućima (Sanz i sur., 2004.).
Azitromicin i klaritromicin inhibiraju LPS-om izazvanu plućnu neutrofiliju u miševa djelujući na oslobađanje GM-CSF i IL-1β iz alveolarnih makrofaga.
Aplicirani p.o. (600 mg/kg) 4 sata prije izazivanja neutrofilije, umanjili su ukupan broj stanica i broj neutrofila u BAI-u, te koncentraciju MPO, CCL-2, GM-CSF, IL-1β, TNF-α i sE-selektina u plućima (Bosnar i sur., 2009.). U in vitro dijelu pokusa azitromicin i klaritromicin umanjili su oslobađanje navedenih citokina iz LPS-om stimuliranih monocita i makrofaga, ne pokazujući učinak na aktivnost epitelnih stanica.
Protuupalno djelovanje na životinjskom modelu plućne fibroze
Azuma i sur. (1998.), u modelu bleomicinom izazvane akutne ozljede pluća u štakora pokazali su da, za razliku od tretmana, predtretman eritromicinom (12 mg/kg, p.o.) smanjuje nakupljanje neutrofila i koncentraciju neutrofilne elastaze u plućima te nastanak edema pluća. U modelu bleomicinske fibroze u štakora u trajanju od 4 tjedna, azitromicin (80 mg/kg) primijenjen tijekom 3 uzastopna dana u tjednu je umanjio aktivnost NF-κB u alveolarnim makrofagima tjedan dana nakon izazivanja fibroze te koncentraciju proteina i ekspresiju mRNK TNF-α i TGF-β u plućima i alveolarnim makrofagima (Chen i sur., 1999.).
Svakodnevni tretman eritromicinom (100 mg/kg, p.o.) u modelu bleomicinske fibroze u štakora smanjio je aktivnost NF-κB 4 dana nakon unosa bleomicina, dok je nakon 7 dana umanjio ekspresiju mRNA IL-1β i TGF-β u plućima. To je smanjilo nakupljanje upalnih stanica i spriječilo nastanak akutne ozljede pluća (Li i sur., 1999.). Također, Li i sur. (2002.) pokazali su da p.o. predtretman eritromicinom (50 mg/kg), klaritromicinom (8,9 mg/kg) i roksitromicinom (10 mg/kg) u modelu bleomicinske fibroze u miševa umanjuje ekspresiju VCAM-1 mRNK i nakupljanje leukocita u plućima, dok u kasnijoj fibrotičnoj fazi smanjuje koncentraciju hidroksiprolina.
Patohistološka analiza pokazala je smanjenje fibrotičnih područja u plućima životinja predtretiranih i tretiranih eritromicinom i klaritromicinom te predtretiranih roksitromicinom.
Predtretman azitromicinom (10 mg/kg, p.o.) tijekom 4 tjedna, u modelima spontane i LPS-om izazvane upale pluća u miševa soja ΔF508 mutiranih u svrhu izazivanja cistične fibroze, rezultirao je smanjenjem nakupljanja upalnih stanica te koncentracije TNF-α i MIP-2 (Legssyer i sur., 2006.). U modelu bleomicinske fibroze u miševa predtretman i tretman s EM703 (75 mg/kg, p.o.) umanjio je nakupljanje makrofaga i neutrofila u dišnim prohodima, te nastanak fibrotičnih područja i nakupljanje hidroksiprolina u plućima. Smanjena ekspresija mRNK Smad proteina 3 i 4 koji su nužni za aktivaciju TGF-β, bila je vraćena na početnu razinu. U in vitro studiji EM703 je u staničnoj kulturi plućnih fibroblasta miševa umanjio proliferaciju kolagena izazvanu s TGF-β (Li i sur., 2006.).
Protuupalno djelovanje na životinjskom modelu difuznog panbronhiolitisa
Kaneko i sur. (2003.) su u modelu DPB-a u miševa, izazvanog i.t. unosom Pseudomonas aeruginosa pokazali da tretman klaritromicinom (10 mg/kg, p.o.) tijekom 7 dana umanjuje ekspresiju MUC5AC na mRNA i proteinskoj razini djelujući na unutarstanične signalne puteve protein kinaza. Trodnevni tretman azitromicinom (20 mg/kg, potkožno (s.c.)) u modelu endobronhijalne infekcije izazvane s Pseudomonas aeruginosa umanjio je nakupljanje upalnih stanica u plućima, neovisno o protubakterijskom djelovanju, što se povezuje s padom koncentracije TNF-α i KC (engl. keratinocyte-derived chemokine). In vitro, azitromicin je smanjio kemotaksiju neutrofila utječući na aktivnost vanstaničng signalnog puta koji je pod utjecajem kinaze 1 i 2 (Tsai i sur., 2004.).
Protuupalno djelovanje na životinjskim modelima edema uške i šape
Tarayre i sur. (1987.) pokazali su da nakon jednokratne lokalne primjene nanošenjem na površinu uške, eritromicin (0,250-1 mg/uški) umanjuje edem uške izazvan krotonskim uljem, kantaridinom i pikril kloridom. Također, eritromicin (2,5 mg/uški) je umanjio edem uške u modelima odgođenog tipa preosjetljivosti izazvane oksazolonom i pikril kloridom.
Tretman roksitromicinom (5 i 20 mg/kg, p.o.) je u modelima edema šape izazvanog karageninom i poly-L-argininom te edema uške izazvanog krotonskim uljem umanjio nastali edem, ali nije utjecao na nastanak granuloma u modelu kronične proliferativne upale izazvane s.c. implantacijom spužvice (Agen i sur., 1993.). Scaglione i Rossoni (1998.) uspoređivali su protuupalne učinke roksitromicina, azitromicina i klaritromicina u karageninom izazvanom modelu edema šape u štakora. Jednokratni predtretman (20 mg/kg, p.o.) je umanjio edem šape, pri čemu je roksitromicin pokazao najjači protuupalni učinak.
Iako su brojna istraživanja pokazala da makrolidi umanjuju edem uške i šape izazvane različitim upalnim agensima, molekularni i stanični mehanizam protuupalnog djelovanja makrolida u ovim modelima nije istražen. Hashimoto i sur. (2003.) pokazali su da klaritromicin (100 mg/kg, p.o., 3 puta tjedno kroz 9 tjedana) u modelu atopičkog dermatitisa u NC/Nga miševa inficiranih sa Staphylococcus aureus, između 5. i 6. tjedna umanjuje pojavnost crvenila, hemoragije, oteknuća, ljuštenja i suhoće kože.
Navedeni se učinak do kraja pokusa (9. tjedna) smanjio. Kao mogući mehanizam djelovanja klaritromicina navode smanjeno nakupljanje degranuliranih mastocita i stanica MHC klase u koži miševa. Međutim, kako je klaritromicin ujedno u potpunosti uklonio nakupine bakterija s površine kože, upitno je da li je navedena učinkovitost posljedica njegova protubakterijskog ili protuupalnog učinka. Nedavno su Ivetić Tkalčević i sur. (2012.) proveli detaljno istraživanje mehanizma protuupalnog djelovanja azitromicina i klaritromicina na urođenu imunosnu reakciju u modelu forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA) izazvane akutne upale uške u miševa te na Th2 potaknut upalni odgovor u modelu oksazolonom (OXA) izazvane akutne i kronične preosjetljivosti odgođenog tipa u miševa. Naneseni topikalno, u dozi od 500 μg/uški, azitromicin i klaritromicin su inhibirali edem uške te nakupljenje leukocita i koncentraciju IL-1ß, TNF-α i MPO u tkivu uške miševa tretiranih s PMA. Imunohistokemijska analiza pokazala je da su testirani makrolidi umanjili koncentraciju IL-1β i TNF-α sprječavanjem nakupljanja polimorfonuklearnih leukocita – osnovnog izvora navedenih citokina. U modelu akutne i kronične preosjetljivosti odgođenog tipa izazvane oksazolonom, azitromicin i klaritromicin su, nakon topikalne primjene u dozi od 1 mg/uški, prije svega utjecali na aktivnost Th2 limfocita. Umanjili su koncentraciju IL-4 i degranulaciju mastocita u tkivu uške, te koncentraciju IgE u serumu. U svjetlu navedene aktivnosti, mehanizam protuupalnih učinaka makrolidnih antibiotika razlikuje se od mehanizma protuupalnih učinaka deksametazona, predstavnika kortikosteroida.
Protuupalno djelovanje na životinjskim modelima sepse
U modelu LPS-om izazvane endotoksemije u miševa, roksitromicin, klaritromicin i azitromicin su, za razliku od josamicina, nakon 4-tjednog predtretmana umanjili koncentraciju NO i ekspresiju mRNA NO sintaze te koncentraciju IL-1β, IL-6 i TNF-α u plazmi. Predtretman u trajanju od 2 tjedna nije pokazao istovjetni učinak (Terao i sur., 2003.). Giamarellos-Bourboulis i sur. (2005.) utvrdili su da se dvokratnim davanjem klaritromicina u dozama od 80 i 50 mg/kg, intravenozno (i.v.) (6 i 8 sati nakon infekcije) u modelu sepse izazvane infekcijom bubrega s Escherichia coli ligacijom uretera izazvanog akutnog pijelonefritisa u zamorčića, produžuje preživljenje životinja i smanjuje koncentraciju LPS-a, TNF-α i malondialdehida u serumu, broj bakterija te nastanak plućnog edema.
Obzirom na problematiku odvajanja protuupalnog od protubakterijskog djelovanja makrolidnih antibiotika, Ivetić Tkalčević i sur. (2006., 2008.) istražili su protuupalne učinke azitromicina u modelu septičkog šoka izazvanog senzibilizacijom i provokacijom životinja LPS-om, te protuupalne učinke klaritromicina u modelu septičkog šoka izazvanog jednokratnom primjenom visoke doze LPS-a.
Predtretman azitromicinom prije senzibilizacije i provokacije (10 i 100 mg/kg, p.o.) te klaritromicinom (jednokratno, 100 mg/kg), povećao je preživljenje životinja, vjerojatno zbog smanjenja koncentracije TNF-α u plazmi. Također, azitromicin je nakon jednokratnog predtretmana (150 mg/kg, i.p.) u modelu LPS-om izazvane plućne neutrofilije značajno smanjio ukupni broj stanica, postotak neutrofila, te koncentraciju TNF-α, IL-6 i MIP-2 u plućima što upućuje na mogućnost njegovog protuupalnog djelovanja na sepsom izazvanu akutnu ozljedu pluća. Leiva i sur. (2007.) pokazali su da predtretman telitromicinom (20 mg/kg, i.p.) u modelu septičkog šoka izazvanog jednokratnom primjenom visoke doze LPS-a smanjuje koncentraciju IL-1β, TNF-α i koncentraciju nitrita, a povećava koncentraciju IL-10 u plazmi i postotak preživljavanja.
Protuupalno djelovanje na ostalim životinjskim modelima
Tone i sur. (2005.) su u modelu streptozocinom izazvanog dijabetesa u štakora ispitivali protuupalne učinke eritromicina na dijabetesom izazvanu nefropatiju u čijoj patogenezi postoji upalna komponenta. Eritromicin (5 mg/kg, p.o. tijekom 8 tjedana) smanjio je aktivaciju NF-κB u bubrezima i tako umanjio glomerularnu hipertrofiju, nakupljanje makrofaga, ekspresiju ICAM-1, TGF-β1 i proteina odgovornog za nastanak kolagena tipa IV te koncentraciju albumina u mokraći ne utječući pri tom na razinu glukoze u krvi i krvni tlak.
U modelu ulcerativnog kolitisa u štakora izazvanog intrakoloničnim unosom 3%-tne octene kiseline, azitromicin i klaritromicin (10, 20 i 40 mg/kg, p.o. tijekom 5 dana) umanjili su edem, nekrozu i nakupljanje upalnih stanica u stijenci crijeva te porast koncentracije MPO, NOS i TNF-α u crijevnom tkivu (Mahgoub i sur., 2005.).
Također, peroralni tretman azitromicinomu do zi od 50 mg/kg/dan tijekom 5 uzastopnih dana, je umanjio akutni kolitis u miševa izazvan dinitrofluorobenzenom.
Azitromicin je umanjio oksidativni stres i oštećenje mukoze crijeva, ne pokazujući učinak na bakterijski sastav crijeva (Plesko i sur., 2010.).
Ianaro i sur. (2000.) ispitivali su protuupalne učinke makrolida u modelu karageninom izazvane upale poplućnice u štakora. Roksitromicin, klaritromicin i eritromicin (10, 20 i 40 mg/kg, p.o. predtretman), za razliku od azitromicina, ovisno o primijenjenoj dozi, značajno su umanjili nakupljanje pleuralnog eksudata i leukocita, te koncentraciju PGE 2 , nitrata, nitrita i TNF-α u eksudatu.
Najbolji protuupalni učinak uočen je kod roksitromicina.
Beigelman i sur. (2010.) istražili su protuupalni učinak azitromicina u mišjem modelu virusnog bronhiolitisa izazvanog sa Sendai virusom (parainfluenca tip 1).
Supkutani tretman azitromicinom (50 mg/kg/dan, 1 h nakon inokulacije virusa) tijekom 7 dana umanjio je nakupljanje leukocita, ponajviše neutrofila, u plućima i njihov ukupni broj u BAI-u.
Također, azitromicin je značajno smanjio koncentraciju G-CSF te je utjecao na smanjenje, iako ne statistički značajno, koncentracije CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, GM-CSF i IFN-γ u BAI-u. Na koncentraciju IL-17 i CXCL1 nije utjecao. Pored navedenog, tretman azitromicinom je ubrzao rezoluciju kronične upale dišnih puteva smanjujući koncentraciju G-CSF i CXCL1 u BAI-u 21. dana pokusa.
Azitromicin nije utjecao na broj virusa u navedenom modelu.
Imunomodulacijski učinci makrolidnih antibiotika
Rezultati in vitro, in vivo i kliničkih studija ukazuju na činjenicu da makrolidi mogu mijenjati urođeni i stečeni imunosni odgovor. Njihova imunomodulacijska svojstva očituju se učincima na imunosne medijatore u upalnim modelima, ali i u zdravom organizmu.
Tilozin je u dozi od 500 mg/kg povisio koncentraciju protuupalnog citokina IL-10 u serumu zdravih miševa, ali nije utjecao nakonc entraciju protuupalnih citokina TNF-α i IL-1β (Er i sur., 2010.). U istom je pokusu, u serumu miševa tretiranih LPS-om, tretman tilozinom (10 – 500 mg/kg) značajno umanjio koncentraciju TNF-α i IL-1β te povisio koncentraciju IL-10. Slično tilozinu, tretman azitromicinom u dozi od 10 mg/kg tijekom 4 tjedna povisio je koncentraciju IL-10 u BAI-u zdravih miševa (Leggsyer i sur., 2006.). U navedenom pokusu azitromicin nije utjecao na koncentraciju MIP-2 i TNF-α u BAI-u.
Osim učinka na protuupalne medijatore, literaturni podatci ukazuju da makrolidi u zdravom organizmu mogu utjecati i na proupalne medijatore.
Sugiura i sur. (1997.) pokazali su da je 14-dnevni tretman roksitromicinom 50 mg/kg) potaknuo oslobađanje slobodnih kisikovih radikala iz neutrofila.
Jednokratna p.o. primjena azitromicina u dozi od 200 mg/kg značajno je povisila koncentraciju proteina akutne faze SAA u serumu zdravih miševa (Ivetić Tkalčević i sur., 2011.). U serumu miševa tretiranih LPS-om azitromicin je snizio koncentraciju SAA.
In vivo studije pokazale su da kratkotrajni tretman makrolidima potiče imunosni odgovor, dok ga dugotrajni tretman umanjuje. Roksitromicin je, nakon p.o. primjene tijekom 14 dana, u miševa izazvao oslobađanje IL-1 i IL-2, dok je dugotrajni tretman kroz 42 dana smanjio njihovu ekspresiju (Gorrini i sur., 2001.). U drugoj je studiji dugotrajna primjena roksitromicina u miševa povećala sintezu upalnih citokina IFN-γ i IL-2, ali i protuupalnog citokina IL-4 (Kita i sur., 1993.). Slični rezultati dobiveni su i u ex vivo studijama. Kod životinja tretiranih eritromicinom (10 mg/kg, p.o.) tijekom 28 dana, izolirani makrofagi oslobađali su povišene koncentracije TNF-α i IL-1β, a splenociti povišene koncentracije IL-4 i IFN-γ (Kita i sur., 1990.). Sedmodnevnom primjenom nije dobiven jednak učinak na promatrane medijatore.
Ortega i sur. (2002.), u ex vivo studiji pokazali su da i primijenjena doza utječe na imunomodulacijsku aktivnost pojedinih makrolida.
Sedmodnevni tretman eritromicinom (7, 14, 28, 57 mg/kg) pojačao je proliferaciju mišjih limfocita. Imunomodulacijski učinak azitromicina i josamicina ovisio je o visini primijenjene doze. Najviša doza je pojačala proliferaciju limfocita, dok su je niže doze umanjile.
Neki makrolidi potiču kemotaksiju fagocita, diferencijaciju monocita u makrofage te fagocitozu makrofagima, dok drugi utječu na proliferaciju makrofaga. Eritromicin, azitromicin i roksitromicin potiču LPS-om izazvanu kemotaksiju makrofaga (Xu i sur., 1996.).
Klaritromicin, midekamin i josamicin umanjuju proliferaciju monocita stimuliranu mitogenima (Morikawa i sur., 1994.). Nadalje, makrolidi pojačavaju aktivnost cAMP u LPS-om stimuliranim monocitima humanog podrijetla, što nije uočeno kod nestimuliranih monocita (Abeyama i sur., 2003.). Klaritromicin umanjuje ekspresiju TNF-α i IL-6 u LPS-om stimuliranim humanim neutrofilima, dok ih prisustvo bakterije Klebsiella pneumoniae pojačava, što ukazuje da makrolidi umanjuju aktivnost stanica stimuliranih LPS-om, a time i oštećenje tkiva (Reato i sur., 2004.). Makrolidi pokazuju i poticajne i suprimirajuće učinke na aktivnost neutrofila. Eritromicin i roksitromicin potiču aktivnost i migraciju neutrofila, a, s druge strane, poticanjem apoptoze smanjuju njihovo preživljavanje (Inamura i sur., 2000.).
Azitromicin potiče baktericidni učinak humanih polimorfonuklearnih stanica (Silvestri i sur., 1995.). Roksitromicin smanjuje oksidativni stres i kemotaksiju humanih neutrofila (Labro i sur., 1989.).
Tretman eritromicinom (p.o.) u zdravih je dragovoljaca pojačao pokretljivost i protubakterijsku aktivnost neutrofila (Fernandes i sur., 1984.), dok je primjena azitromicina akutno pojačani oksidativni stres kasnije zamijenila njegovim smanjenjem i povećanom apoptozom neutrofila (Čulić i sur., 2002.). Eritromicin i midekamicin smanjuju ekspresiju MAC-1 na perifernim neutrofilima pacijenata oboljelih od DPB-a (Okubo, 1997.).
Makrolidi pokazuju imunomodulacijski utjecaj i na aktivnost limfocita. Eritromicin smanjuje proliferaciju T-limfocita i njihov odgovor na stimulaciju s IL-2 (Keicho i sur., 1993.). Azitromicin je u zdravih dragovoljaca smanjio aktivnost limfocita, a povećao aktivnost IL-2 receptora (Suzuki i sur., 1997.). Ishida i sur. (2007.) tretirali su antigen-prezentirajuće dendritičke stanice klaritromicinom i roksitromicinom.
Makrolidi su umanjili proliferaciju CD4 + T-limfocita stimuliranih s P6 te stvaranje IFN-γ, IL-5 i IL-8, a povisili koncentraciju IL-4.
Za razliku od brojnih dokaza o imunomodulacijskim učincima makrolida na urođeni imunosni odgovor, podataka o njihovom učinku na stečeni odgovor znatno je manje. Woo i sur. (2004) cijepili su miševe tetanus toksoidom (inaktivirani toksin ovisan o T-limfocitima), zatim pneumokoknim polisaharidnim cjepivom (neovisno o T-limfocitima), cjepivom površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg, engl. hepatitis B virus surface antigen, rekombinantni protein) te živim atenuiranim cjepivom Salmonella typhi (Ty21a). Tretman klaritromicinom (50 mg/kg, i.p.) provodio se svakodnevno počevši 24 h prije cijepljenja do 27. dana poslije cijepljenja, odnosno 20. dana nakon cijepljenja u slučaju Ty21a cjepiva. Klaritromicin je smanjio stvaranje protutijela na antigene ovisne i neovisne o T-limfocitima, dok je u životinja cijepljenih s Ty21a pojačao je stvaranje protutijela.
Jednokratni pretretman azitromicinom (50 mg/kg, i.p.), sat vremena prije cijepljenja miševa inficiranih i.n. s Streptococcus pneumoniae serotip 14s, s 7-valentnim cjepivom polisaharidnog pneumokoknog konjugata (PCV7), umanjuje imunosni odgovor smanjenim stvaranjem protutijela i usporenim uklanjanjem bakterija iz nosnih šupljina (Fernandez i sur., 2004.).
Zaključak
U kliničkoj praksi danas postoji značajan broj upalnih bolesti ili stanja, poput septičkog šoka, kronične opstruktivne bolesti pluća, psorijaze i atopičkog dermatitisa, s oštećenjem tkiva kao posljedicom neprekidnog imunosnog odgovora, a za koje ne postoji primjerena terapija. Protuupalna terapija najvećim se dijelom zasniva na učincima steroidnih protuupalnih lijekova koji, pored protuupalnog djelovanja, posjeduju i dosta izražene neželjene popratne pojave. Također, nesteroidni protuupalni lijekovi sa selektivnimuč incima, poput anti-TNF-α terapeutika u stanju septičkog šoka nisu pokazali očekivanu djelotvornost. Svaki doprinos boljoj protuupalnoj terapiji je više nego poželjan. Rezultati in vitro i in vivo studija, ali i primjeri iz kliničke prakse, ukazuju na postojanje protuupalnih i imunomodulacijskih svojstava makrolida koji nisu vezani uz njihovo protubakterijsko djelovanje.
Brojni in vitro pokusi provedeni posljednjih desetljeća ukazali su na utjecaj makrolida na adheziju, kemotaksiju, stvaranje citokina i kemokina, degranulaciju polimorfonukleara i fagocitozu, oksidativni učinak i staničnu apoptozu.
In vivo i kliničke studije upućuju na njihovo protuupalno djelovanje u smislu nakupljanja upalnih stanica i oslobađanja upalnih čimbenika – citokina, kemokina, adhezijskih molekula i slobodnih kisikovih radikala. Također, proupalni učinci makrolidnih antibiotika na urođeni i stečeni imunosni odgovor ukazuju i na njihove imunomodulacijske učinke. Zbog relativno slabe toksičnosti, neselektivnosti i relativno velikog volumena raspodjele, makrolidi bez protubakterijskog djelovanja predstavljaju poželjnu skupinu mogućih protuupalnih lijekova.
Međutim, unatoč objavljenim rezultatima, mehanizam njihovog protuupalnog i imunomodulacijskog djelovanja i dalje je nepoznat.
Sažetak
Svrha ovog preglednog rada bila je prikazati protuupalna i imunomodulacijska svojstva makrolidnih antibiotika (makrolida).
Tijekom godina istraživanja makrolida u in vitro i in vivo sustavima te praćenja rezultata njihove kliničke uporabe, uočeno je da, pored protubakterijskih učinaka, pokazuju protuupalna i imunomodulacijska svojstva. U in vitro uvjetima uočeno je djelovanje makrolida na različite upalne procese, primjerice adheziju, kemotaksiju, izlučivanje citokina i kemokina. Protuupalni učinci makrolida in vivo, u smislu nakupljanja upalnih stanica i oslobađanja različitih upalnih čimbenika – citokina, kemokina, adhezijskih molekula i slobodnih kisikovih radikala, većinom su proučavani na upalnim procesima dišnog sustava. Brojnim istraživanjima dokazan je utjecaj makrolida na patofiziološke procese koji se javljaju tijekom upalnih stanja, poput difuznog panbronhiolitisa, cistične fibroze, astme i sepse, kao i činjenica da protuupalni učinak nije vezan za njihovo protubakterijsko djelovanje. Osim protuupalnog, makrolidi pokazuju i imunomodulacijsko djelovanje poticanjem imunosnog odgovora. Mehanizam protuupalnog i imunomodulacijskog djelovanja makrolida, unatoč brojnim istraživanjima, za sada još uvijek predstavlja nepoznanicu.
Naši podatci o mogućem molekularnom i staničnom mehanizmu protuupalnih učinaka makrolidnih antibiotika raspravljeni su u kontekstu pokusnog razvoja lokalne upale i sepse izazvane lipopolisaharidom bakterijskog podrijetla.
Literatura [… prikaži]
Anti-inflammatory and Immunomodulatory Effects of Macrolide Antibiotics in the In Vitro and In Vivo Experimental Models
Vanesa Ivetić Tkalčević, DVM, PhD, Miroslava Dominis Kramarić, DVM, MSc, Zagreb
The aim of this review article was to present the anti-inflammatory and immunomodulatory effects of macrolide antibiotics (macrolides). During the years of investigation of macrolides in the in vitro and in vivo experimental models, and monitoring the results of their clinical use, it was observed that they exhibit anti-inflammatory and immunomodulatory properties. In vitro, macrolides affect various inflammatory processes, such as the adhesion, chemotaxis, and secretion of cytokines and chemokines.
The anti-inflammatory effects of macrolides in vivo, in terms of accumulation of inflammatory cells and release of various inflammatory mediators – cytokines, chemokines, adhesion molecules and free oxygen species, have mostly been studied in inflammatory processes of the respiratory system. These studies demonstrated the effect of macrolides on the inflammatory pathophysiological processes that occur in diffuse panbronchiolitis, cystic fibrosis, asthma and sepsis, showing that macrolide anti-inflammatory effects are unrelated to their antibacterial activity.
Besides anti-inflammatory effects, macrolides exert immunomodulatory activity as well, by induction of the immune responses.
The mechanism of anti-inflammatory and immunomodulatory activity of macrolides is still unknown.
Our experimental dana indicating the possible molecular and cellular mechanism of macrolide anti-inflammatory and immunomodulatory effects have been discussed in the context of experimental sepsis induced by bacterial lipopolysaccharide and topical inflammation.