Prvi nalaz trakavice Echinococcus multilocularis u Republici Hrvatskoj

Relja Beck¹, Željko Mihaljević², Renata Brezak¹, Sanja Bosnić¹, Ivana Lohman Janković³, Peter Deplazes⁴

¹Laboratorij za parazitologiju, Odjel za bakteriologiju i parazitologiju, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska, ²Laboratorij za patologiju, Odjel za patološku morfologiju, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska, ³Ministarstvo poljoprivrede, Uprava za Veterinarstvo i sigurnost hrane, Zagreb, ⁴Institute of Parasitology, University of Zürich, Zürich, Switzerland

Izlaganje sa Znanstveno-stručnog skupa

6. HRVATSKI VETERINARSKI KONGRES

SažetakUvodMaterijal i metodeRezultatiDiskusijaLiteraturaAbstract

Izvor: Zbornik radova 6. HRVATSKI VETERINARSKI KONGRES

Sažetak

---

Trakavica Echinococcus multilocularis je parazit prisutan u cijeloj sjevernoj hemisferi. Uzročnik je humane alveolarne ehinokokoze (AE), zoonoze sa visokom stopom smrtnosti ukoliko se ne liječi. Pretpostavlja se da su trenutno najjužnije granice rasprostranjenosti ovog nametnika u Europi, u Sloveniji i Mađarskoj gdje je invazija s E. multilocularis dokazana u crvenim lisicama (Vulpes vulpes), koja je ujedno i glavni nositelj ove trakavice u Europi. U 2015. godini, Ministarstvo poljoprivrede, Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane, financirala je program za istraživanje prisutnosti E. multilocularis u Hrvatskoj, u kojem je E. multilocularis otkrivena u 7,5% lisica lančanom reakcijom polimerazom i neposrednim sekvenciranjem.

---

Ključne riječi: Echinococcus multilocularis, PCR, lisice, Hrvatska

▲

Uvod

Ehinokokoza je zoonoza prisutna u cijeloj Europi i smatra se re-emergentnom bolesti.
Uzročnici bolesti su trakavice Echinoccocus granulosus koje u ljudi uzrokuju cističnu ehinokokozu i E. multilocularis koje u ljudi uzrokuju alveolarnu ehinokokozu. Premda je učestalost i proširenost cistične ehinokokoze znatno veća, smrtnost uslijed alveolarne ehinokokoze iznosi i do 70%, stoga ova trakavica predstavlja vrlo ozbiljnu opasnost za ljudsko zdravlje (Eckert, 2004). Najznačajniji nositelji i istovremeno i rezervoari trakavice E. multilocularis su lisice (Vulpes vulpes) (Gottstein i sur., 2015). U Europi je učestalija u Sjevernoj Europi i Središnjoj Europi dok u Južnoj Europi prema sadašnjim podacima ne predstavlja problem odnosno nije dokazana. Trenutno, najjužnije granice rasprostranjenosti ovog parazita u Europi predstavljaju Slovenija (Vergles Rataj i sur., 2010) i Mađarska (Casulli i sur., 2010) u kojih je dokazana u 2,9% i 10,7% lisica.
Zbog svoje opasnosti za zdravlje ljudi danas se u gotovo svim zemljama EU provodi monitoring lisica kao konačnih nositelja sa ciljem određivanja proširenosti. Do sada, prisutnost i proširenost E. multilocularis u Hrvatskoj nije istraživana stoga je cilj ovoga rada prikazati prvi dokaz ove trakavice u Republici Hrvatskoj kao i njenu proširenost u lisica.

▲

Materijal i metode

U ovom istraživanju pretraženo je 238 uzoraka izmeta iz lešina lisica dostavljenih u Hrvatski veterinarski institut tijekom 2015. godine. Prilikom sekcija uzeti su uzorci izmeta lisica koji su zatim pohranjeni na -80 °C tijekom 4 tjedna. DNA je bila izdvojena izravno iz 200 mg fecesa pomoću QIAamp^® DNA Stool Mini kita prema protokolu proizvođača. Navedeni kit je korišten pri izolaciji DNA jer ima InhibitEX tablete koje vežu inhibitore polimeraze kako bi izbjegli lažno negativne rezultate. Svi uzorci su analizirani pomoću dva protokola lančanom reakcijom polimerazom (PCR) specifičnim za trakavicu E. multilocularis. Umnažani su odsječci mitohondrijskog gena nad1, početnicama Cest1 TGCTGATTTGTTAAAGTTAG TGATC i Cest2 CATAAATCAATGGAAACAAC AACAAG (Trachsel i sur., 2007) dok je 12S ribosomala RNA umnažana početnicama H15 EM CCATATTACAACAATATTC CTATC-H17EM GTGAGTGATTC TTGTTAGGGGAAG (Stieger i sur., 2002).

U PCR reakcijama je korišten GoTaq G2 HotStart mastermix (Promega), početnice koncentracije 10 mol/μL, te 5 μL ranije izdvojene DNA u ukupnom volumenu od 50 μl. Uspješnost umnožavanja je kapilarnom elektroforezom QIAEXCEL-om (Qiagen, Hilden, Germany). Uspješno umnoženi uzorci pročišćeni su pomoću ExoSAP-IT CLEAN UP (USB, SAD), prema uputama proizvođača. Rezultati određivanja nukleotidnih sljedova obrađeni su pomoću računalnog programa Lasergene (DNASTAR, Madison WI, USA) s pripadajućim potprogramima SeqMan i EditSeq. Dobiveni nukleotidni sljedovi su poravnani računalnim potprogramom Seqman i uspoređeni sa poznatim nukleotidnim sljedovima u banci gena (BLAST).
Svi pretraženi uzorci su mapirani prema podacima dostavljenim iz ovlaštene veterinarske organizacije koja je dostavila lešine. Rasprostranjenost pozitivnih lisica je mapirana pomoću ArcMap 10,2 programa kako bi se precizno procijenila proširenost, ali i gustoća invadiranih lisica na istraživanim područjima.

▲

Rezultati

Odsječci veličine 200 bp (12SrRNA) i 395 bp (nad1) umnoženi su u 18 i 20 od ukupno 238 uzoraka. Trakavica Echinococcus multilocularis je potvrđena sekvenciranjem oba gena u 18 uzoraka, dok sekvencioniranje dva uzorka nije uspjelo. Pozitivan uzorak definiran je pozitivnim nakon uspješnog sekvenciranjem oba gena. Dobivene sekvence su nakon usporedbe sa dostupnim sekvencama u NCBI bazi pokazale 100% jednakost sa brojnim sekvencama trakavice E. multilocularis sa područja Europe. Ukupna učestalost u sadašnjem istraživanju je iznosila 7.5% (CI 4,2% do 10,92%). Mapiranjem pozitivnih i negativnih lisica bilo je razvidno da je većina invadiranih lisica potjecala iz zapadne i sjeverozapadne Hrvatske, što je ujedno i područje s najvećom gustoćom zaraženih životinja. Dvije invadirane lisice otkrivene su u planinskom području Gorskog Kotara na oko 460 metara nadmorske visine, 18 km od Jadranske obale.

▲

Diskusija

U Republici Hrvatskoj su dobro poznate dvije zoonotske bolesti uzrokovane parazitima – trihineloza i ehinikokoza. Dok je trihineloza bila endemijska u istočnoj Hrvatskoj (Marinculić i sur., 2001) ehinokokoza uzrokovana trakavicom E. ganulosus se smatrala bolešću Dalmacije i otoka (Morović i sur., 1997). Za razliku od intenzivne kliničke manifestacije trihineloze u ljudi, dokaz cistične ehinokoze u ljudi je često predstavljala “slučajan” nalaz. Prilikom uzorkovanja lisica u programu oralne vakcinacije lisica protiv bjesnoće u Republici Hrvatskoj tijekom 2015. godine dokazani su DNA odsječci karakteristični za trakavicu E. multilocularis u fecesu lisica. Kako bi bili sigurni da se radi o navedenoj trakavici, svi uzorci su pretraženi sa dva molekularna protokola, a umnoženi odsječci oba gena su sekvencirani čime je po prvi puta u Republici Hrvatskoj dokazan uzročnik alveolarne ehinokoze ljudi. U ovom istraživanju učestalost od 7.5% (CI 4,2% do 10,92%) je veća od one dokazane u lisica u Sloveniji (2,9%) (Vergles Rataj i sur., 2010) i neznatno niža od postotka invadiranih lisica u susjednoj Mađarskoj (10,7%) (Casulli i sur., 2010). Lisice Slovenije i Hrvatske dijele isto ekološko područje stoga je bilo i za očekivati da će najveća gustoća pozitivnih lisica biti upravo u sjeverozapadnoj Hrvatskoj.

Sekvence oba gena su pokazale jednakost sa brojnim sekvencama iz različitih područja Europe što ukazuje na izostanak značajne heterogenosti E. multilocularis u Europi, odnosno njezino postupno širenje diljem Europe. Do sada su južne granice zemljopisne proširenosti predstavljali nalazi u Sloveniji i Mađarskoj stoga je ovaj nalaz neobično važan jer predstavlja najjužniji nalaz ovog parazita u Europi (Guerra i sur.; 2014; Manfredi i sur., 2006). U istraživanju koje su proveli Rajković-Janje i suradnici na lisicima sa područja Zagreba nisu dokazali E. multilocularis pregledom crijeva. Teško je sa sigurnošću tvrditi da sadašnji nalaz ukazuje na nedavni prijelaz ove trakavice u Republiku Hrvatsku jer u sadašnjem istraživanju, lisice sa područja Zagreba i dalje nisu invadirane, stoga je potrebno pretražiti veći broj lisica. Do sada je na području Republike Srbije dokazan larvalni stadij u dabra koji je uvezen iz Njemačke (Ćirović i sur., 2012). U ovom slučaju se nije radilo o autohtonoj alveolarnoj ehinokokozi što je i potvrđeno izostankom trakavica iz pretraženih lisica sa područja Srbije (Pavlović 1994; Ilić i sur., 2016).

Posebice je zanimljiv nalaz dvije invadirane lisice iz planinskog područja Gorskog Kotara na oko 460 metara nadmorske visine, 18 km od Jadranske obale. Jajašca trakavice E. multilocularis su prilagođena niskim temeperaturama što omogućava njihovo preživljavanje i posljedično širenje na područja slobodna od alveolarne ehinokokoze.

Ovim istraživanjem po prvi puta je dokazana prisutnost trakavice E. multilocularis u Republici Hrvatskoj. Cistična ehinokokoza u ljudi je često predstavljala “slučajan” nalaz, za razliku od alveolarne ehinokokoze koja može prouzročiti smrt u gotovo 70% oboljelih. Stoga je poznavanje proširenosti nužno za prevenciju invazije ljudi. Do sada u Republici Hrvatskoj nije dokazan slučaj alveolarne ehinokoze tako da je ovaj nalaz izuzetno važan sa aspekta javnog zdravstva i mjera kontrole ehinokoze (Gottstein i sur., 2015).

Literatura [… prikaži]

▲

Relja Beck, Željko Mihaljević, Renata Brezak, Sanja Bosnić, Ivana Lohman Janković, Peter Deplazes

FIRST DETECTION OF ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS IN CROATIA

Abstract

---

Echinococcus multilocularis is a tapeworm present throughout the Northern Hemisphere. It is the causative agent of human alveolar echinococcosis (AE), a severe zoonotic disease with a high mortality rate if not treated. Currently, the southernmost limits of distribution of this parasite in Europe are assumed to be Slovenia and Hungary of intestinal E. multilocularis infections reported in red foxes, the principal definitive host of E. multilocularis in Europe. In 2015, the Ministry of Agriculture, Veterinary and Food Safety Directorate, Croatia, financed the first surveillance programme to investigate if E. multilocularisis present in Croatia in wich E. multilocularis was detected in 7,5% of foxes with PCR and subsequent sequencing.
Key words: Echinococcus multilocularis, PCR, foxes, Croatia