N. Kudumija*, A. Vulić, T. Lešić, L. Dergestin Bačun, Z. Dugonjić Odak i J. Pleadin
Sažetak
S orbinska kiselina i njezine soli, kalijev i kalcijev sorbat prehrambeni su aditivi, odnosno konzervansi s antimikrobnim djelovanjem koji inhibicijski djeluju na plijesni i kvasce, ali i na neke bakterije. Sorbinska kiselina, zbog navedenih svojstava, ima široku primjenu u prehrambenoj industriji, a naročito za konzerviranje mliječnih proizvoda, slastičarskih i pekarskih proizvoda, majoneza, namaza, suhog voća, vina te za površinsku obradu prerađenih mesnih proizvoda. Mehanizam antimikrobnog djelovanja sorbata još nije u potpunosti istražen. Preporučeni dnevni unos sorbinske kiseline iznosi 25 mg/kg tjelesne mase te se smatra najmanje tosičnim konzervansom, iako u kombinaciji s drugim aditivima može stvarati spojeve štetne za zdravlje. Kako bi se utvrdilo moguće prekoračenja najveće dopuštene količine (NDK) sorbinske kiseline u proizvodima životinjskog podrijetla, tijekom petogodišnjeg razdoblja (2018. – 2022.) s hrvatskog tržišta prikupljeno je i analizirano 725 uzoraka, od čega 445 uzoraka mliječnih proizvoda i 280 uzoraka mesnih proizvoda. Od ukupnog broja uzoraka, sorbinska kiselina detektirana je u 37 uzoraka. Količina sorbinske kiseline u mesnim proizvodima kretala se u rasponu 6-73 mg/kg te u mliječnim proizvodima 6-797 mg/kg. U niti jednom od analiziranih uzoraka nije određena količina ovog aditiva veća od NDK definirane zakonodavstvom. Međutim, u cilju zaštite zdravlja potrošača nužna je daljnja sustavna kontrola ovog prehrambenih aditiva.Ključne riječi: prehrambeni aditivi, sorbinska kiselina, sorbati, mliječni proizvodi, mesni proizvodi
Uvod
Sorbinska kiselina je mononezasićena masna kiselina (2,4-heksadienolna kiselina) za koju su prvom polovicom prošlog stoljeća utvrđena i antimikrobna svojstva. Sorbinska kiselina (E 200) i njezine soli kalij sorbat (E 202) i kalcij sorbat (E 203) su konzervansi koji imaju inhibitorna svojstva te djeluju na plijesni, uključujući i plijesni producente mikotoksina (Penicillium patulum, Penicillium roqueforti, Aspergillus flavus) i neke bakterije iz rodova Salmonella, Clostridium i Staphylococccus (Davidson i sur., 2002., Emerton i Choi, 2008.). Mehanizam antimikrobnog djelovanja sorbinske kiseline još nije u potpunosti razjašnjen, no pretpostavlja se da otapa stanične membrane mikroorganizama, prodire i zadržava se u stanicama te djeluje inhibitorno na enzime uključene u metabolizam (Davidson i sur., 2002.). Neutralan okus i miris važna je karakteristika sorbata, budući da njihov dodatak u proizvod dodatno ne utječe na senzorska svojstva (Bajčić i sur., 2021.).
Stabilnost sorbata u hrani ovisi o više faktora, a najznačajniji su: pH, aktivitet vode, koncentracija mikroorganizama, nutritivni sastav te prisutsvo drugih aditiva (EFSA, 2019.). Sorbati se kao konzervansi koriste u različitim granama prehrambene industrije, naročito industriji mliječnih i slastičarskih proizvoda, dijetalnih napitaka, dresinga za salate, majoneze, za površinsku obradu mesnih proizvoda (Davidson i sur., 2002.), suhog voća te u proizvodnji vina, budući da zaustavljaju fermentacijske procese izazvane aktivnošću kvasaca (Pongsavee i Mishra, 2021.). Vrlo se često koriste i u kombinaciji s drugim konzervansima (Emerton i Choi, 2008.). Kovačević (2014.) navodi da u cilju sprječavanja prekomjerne pljesnivosti ovitka u tehnološkom procesu proizvodnje kulena, nakon mehaničkog uklanjna plijesni, uzorak kulena treba tretirati uranjanjem ili raspršivanjem 5%-tnom vodenom otopinom kalijevog sorbata koji spriječava rast kvasaca i plijesni. Literaturni podatci navode da kalijev sorbat u kombinaciji s vakuum pakiranjem značajno utječe na produžetak roka trajanja proizvoda (Ačkar i Rot, 2019.).
Preporučeni dnevni unos za sorbinsku kiselinu iznosi 25 mg/kg tjelesne mase (EFSA 2015.). Smatra se da je sorbinska kiselina jedan od najmanje toksičnih antimikrobnih konzervansa koji se koriste u prehrambenoj industriji (Davidson i sur., 2002.). Istraživanja su pokazala da sorbati u kombinaciji s nitritima i askorbinskom kiselinom u gastrointenstinalnom traktu mogu stvarati spojeve s karcinogenim potencijalom (Kraemer i sur., 2021.). Pongsavee i Mishra (2021.) navode da kalijev sorbat može prouzročiti kromosomske aberacije te da dogoročno izlaganje može negativno utjecati na zdravlje. Kitano i sur. (2002.), Hoang i Vu (2016.), Piper i Piper (2017.) ukazuju da kalijev sorbat u kombinaciji s askorbinskom kiselinom (vitamin C) u prisutnosti iona željeza utječe na mutagenost i oštećenje DNK.
Zbog navedenih razloga nužna je sustavna kontrola prisutnosti ovog aditiva, čija uporaba treba biti tehnološki opravdana.
Ovaj rad daje pregled rezultata određivanja sadržaja sorbinske kiseline u proizvodima životinjskog podrijetla s hrvatskog tržišta tijekom petogodišnjeg razdoblja (2018. – 2022.) i usporedbu utvrđenih količina s najvećim dopuštenim količinama (NDK) definiranih zakonodavstvom.
Materijali i metode
Uzorci
Uzorkovanje finalnih proizvoda životinjskog podrijetla provedeno je u industrijama i supermarketima na tržištu Republike Hrvatske tijekom petogodišnjeg razdoblja od 2018. do 2022. godine.
Uzorkovani finalni proizvodi pripadali su različitim vrstama, odnosno kategorijama mliječnih i mesnih proizvoda različitih domaćih i stranih proizvođača.
Svaki uzorak nabavljen je u količini od minimalno 500 grama. Prikupljeno je ukupno 725 uzoraka, od čega 445 uzoraka mliječnih proizvoda i 280 uzoraka mesnih proizvoda.
Priprema uzoraka
Svi uzorci su pripremljeni prema normi HRN ISO 9231 Mlijeko i mliječni proizvodi – Određivanje udjela benzojeve i sorbinske kiseline (ISO 9231:2008). Fermentirani mliječni proizvodi homogenizirani su zagrijavanjem u vodenoj kupelji pri 40 ˚C uz lagano miješanje. Nakon homogenizacije, odvagano je 20 g (±0,1 g) homogenog fermentiranog uzorka u odmjernu tikvicu od 100 mL. Nadalje, mesni proizvodi i ostale vrste mliječnih proizvoda homogenizirani su u laboratorijskom homogenizatoru (Grindomix GM 200, Retsch, Njemačka) te je 3 grama (± 0,1 g) proizvoda odvagano u odmjernu tikvicu od 100 mL uz dodatak 20 mL demineralizirane vode. Nakon toga, u sve uzorke dodano je 25 mL otopine natrij hidroksida (0,1 mol/L) te je odmjerna tikvica uronjena u ultrazvučnu kupelj (Sonorex, Bandelin, Njemačka) tijekom 15 minuta. Nakon ultrazvučne ekstrakcije pH uzoraka podešen je na 8±1 dodatkom sulaftne kiseline (0,5 mol/L). Slijedilo je dodavanje 2 mL otopine kalij heksanocijanoferat (II) i 2 mL otopine cink acetata uz mućkanje, kako bi se istaložile masti i bjelančevine. Nakon taloženja u uzorke je dodano oko 40 mL metanola; uzorci su hlađeni do sobne temperature te su nadopunjeni metanolom do oznake. Uzorci su potom filtrirani kroz filtar papir (Crna vrpca, Machenerey-Nagel, Njemačka) te dodatno kroz filtar od regenerirane celuloze veličine pora 0,45 µm (RC membrane, 0,45 µm, Phenomenex, Njemačka) direktno u vijalu.
Reagensi i standardi
Standard sorbinske kiseline visoke čistoće nabavljen je od tvrtke Supelco (Bellefonte, Pennsylvania, SAD); ultra čista voda elektrolitičke provodljivosti ≤ 0,05 µS/cm dobivena je uređajem DirectQ 3 UV (Merck, Darmstadt, Njemačka).
Metanol, kalij dihidrogen fosfat i kalij hidrogen fosfat trihidrat bili su visoke čistoće, a kalij-heksanocijanoferat (II) trihidrat, cink acetat, octena kiselina i sulfatna kiselina p.a. čistoće.
Instrumentalna analiza
Sorbinska kiselina analizirana je metodom tekućinske kromatografije ultra visoke djelotvornosti (UHPLC) s UV-Vis detekcijom. Tekućinski kromatograf sastojao se od kvaterne pumpe, odjeljka za kolonu, automatskog uzorkovača i UV-Vis detektora (1260 Infinity, Agilent Technologies Lake Forest, SAD). Analitička kolona bila je ZORBAX Eclipse Plus C18 dimenzija 2,1 x 50 m veličine čestica 1,8 μm (Agilent Technologies Lake Forest, SAD). Mobilna faza sastojala se od fosfatnog pufera pH=6,7 i metanola u omjeru 90/10. Analiza je provedena pri sobnoj temperaturi uz izokratni protok mobilne faze 0,3 mL/min, volumen injektiranja od 2 μL te valnu duljinu UV-Vis detektora od 250 nm. Prema normi, kalibracijska krivulja sastojala se od dvije točke.
Verifikacija i validacija metode
Verifikacija metode provela se dokazivanjem parametra istinitosti uz uporabu sirove kobasice kao referentnog materijala (DRRR-Proficiency testing, Kempten, Njemačka). Uzorak referentnog materijala analizirala su dva analitičara u 6 replika. Na temelju dobivenih rezultata izračunato je iskorištenje (%).
U cilju validacije metode, limit detekcije (LOD) i limit kvantifikacije (LOQ) određeni su i izračunati prema International Conference on Harmonisation (ICH, 2014.).
Linearnost metode provjerena je određivanjem koeficijenta korelacije kalibracijskog pravca.
Statistička obrada podataka
Statistička analiza provedena je primjenom računalnog programa Statistica Ver. 7 software (StatSoft Inc.,Tulsa, OK, SAD, 1994-2004). Za testiranje statistički značajnih razlika u količinama sorbinske kiseline korišten je ANOVA test na razini značajnosti p=0,05.
Rezultati i rasprava
Metoda se s obzirom na dobivene vrijednosti verifikacijskih i validacijskih parametara te rezultate usporednog testiranja („z“ vrijednost), smatra prikladom za određivanje sorbinske kiseline u hrani životinjskog podrijetla.
Sorbinska kiselina detektirana je u 5,10 % uzoraka, a sadržaj sorbinske kiseline određen u proizvodima životinjskog podrijetla s hrvatskog tržišta prikazan je u Tabeli 2.
1uzorci sa sadržajem sorbinske kiseline većim od LOQ; 2srednja vrijednost rezultata većih od LOQ.
Vidljivo je da su određene manje količine sorbinske kiseline u mesnim proizvodima u odnosu na mliječne proizvode, a kretale su se u rasponu od 6 do 73 mg/kg. U kategoriji mesnih proizvoda određena je i najniža frekvencija uzoraka sa sadržajem sorbinske kiseline većim od LOQ vrijednosti, a iznosila je 3,32 %. U skupini mliječnih proizvoda, sorbinska kiselina određena je u 6,29 % uzoraka, a količine su se kretale u rasponu od 6-797 mg/kg.
Sadržaj sorbinske kiseline u različitim kategorijama mesnih proizvoda prikazan je na slici 1.
Polutrajne kobasice sadržavale su prosječno 12,38 mg/kg sorbinske kiseline, trajne kobasice 29,22 mg/kg i obarene kobasice 42,45 mg/kg.
Između ovih kategorija proizvoda nije utvrđena statistički značajna razlika u sadržaju sorbinske kiseline (p=0,271).
Rezultati istraživanja sorbinske kiseline u mesnim i mliječnim proizvodima iz europskih zemalja nisu objavljivana te time podatke iz ovog istraživanja sa njima nije moguće usporediti. U svijetu Hoang i Vu (2016.) detektirali su kalijev sorbat u 22 od 90 analiziranih uzoraka mesnih proizvoda te je 2,2 % analiziranih uzoraka sadržavalo količinu sorbata veću od NDK vrijednosti (1000 mg/kg) propisanu vijetnamskim zakonodavstvom. Količina sorbata u navedenom istraživanju kretala se u rasponu od 5,5-1814,0 mg/kg u kobasicama i 9,92-163,44 mg/kg u šunkama, dok u paštetama sorbati nisu detektirani. Rezultati spomenutog istraživanja razlikuju se od naših i s obzirom na frekvenciju pozitivnih uzoraka (24,4 % vs. 3,32 %) i s obzirom na količinu sorbinske kiseline. Nadalje, u istraživanju koje su proveli Do i Choi (2001.), prosječna količina sorbinske kiseline u šunkama iznosila je 0,32 g/kg, a u kobasicama 0,44 g/kg te ni u jednom uzorku nije dektektirana količina veća od NDK (2,0 g/kg) propisana koreanskim zakonodavstvom. Količina sorbata u uzorcima mesnih proizvoda s brazilskog tržišta kretala se u rasponu od 54,0 – 440,4 mg/kg u kobasicama, 76,9 – 328,0 u hrenovkama te 378,7 – 976,4 mg/kg u mortadeli. Nadalje, u svakoj od analiziranih skupina mesnih proizvoda neke od detektiranih vrijednosti prelazile su NDK vrijednosti (200 mg/kg) propisane brazilskim zakonodavstvom (Mesquita i sur., 2018.).
Europsko zakonodavstvo ne propisuje NDK vrijednosti za sorbinsku kiselinu za mesne proizvode, osim za paštete i aspik. Općenito, uporaba sorbinske kiseline u mesnoj industriji vrlo je ograničena te se ista ne koristi za tretiranje neprerađenog mesa, a primjenjuje se u toplinski obrađenom prerađenom mesu (paštete, aspik) u količini do 1000 mg/kg, za tretiranje crijeva i ovoja za mesne proizvode (do 1000 mg/kg) te u tretiranju vanjske površine suhomesnatih proizvoda u količini quantum satis (EZ 1333/2008 i EZ 2018/98).
Zbog dobrih antimikrobnih svojstava, u kombinaciji s rezistencijom na bakterije mliječne kiseline (Robach i Sofos, 1982., Mroueh, 2008.), u odnosu na mesnu industriju, značajnija je uporaba sorbata u mliječnoj industriji. Zbog same prirode tehnološkog procesa proizvodnje tvrdih sireva, tijekom dozrijevanja, a ovisno o relativnoj vlažnosti zraka, trajanju zrenja, higijenskim uvjetima u prostoriji, sir obrastaju plijesni te se primjenjuju fungicidni premazi na bazi sorbinske kiseline i njezinih soli (Kalit, 2015.). Slika 2. prikazuje srednje vrijednosti sadržaja sorbinske kiseline detektirane u pojedinim kategorijama mliječnih proizvoda.
Najniže srednje vrijednosti koncentracije sorbinske kiseline u mliječnim proizvodima određene su u jogurtu (10,50 mg/kg) i polutvrdim sirevima (14,33 mg/kg), dok su značajno veće određene u tvrdom siru (184,80 mg/kg), a posebice u topljenom siru (260,93 mg/kg). Udio sorbinske kiseline u jogurtu kretao se u rasponu od 7 do 14 mg/kg, u topljenim sirevima od 7 do 797 mg/kg, polutvrdim sirevima od 9 do 23 mg/kg, te u tvrdim sirevima od 6 do 605 mg/kg. Visoke koncentracije sorbinske kiseline u jugurtima, u rasponu od 89,3 do 3719,1 mg/kg i 26,33 do 186,0 mg/kg, navode Mroueh i sur. (2008.) i Koyuncu i Uylaster (2009.). Nadalje, Koyuncu i Uylaster (2009.) su odredili koncentracije sorbinske kiseline u sirevima u rasponu od 2,09 do 393 mg/kg, a Özdemir i sur. (2020.) u rasponu 21,30-511,3 mg/kg. U ovom istraživanju, od svih analiziranih uzoraka životinjskog podrijetla, u topljenom siru određena je maksimalna koncentracija od 797 mg/kg sorbinske kiseline. Svi uzorci mliječnih proizvoda obuhvaćeni ovim istraživanjem udovoljavali su s obzirom na najveće dopuštene količine sorbinske kiseline, propisane zakonodovastvom (EZ 1129/2011 i EZ 2018/98).
Zaključak
Literatura [… prikaži]
Sorbic acid – an additive with antimicrobial action in foods of animal origin
Nina KUDUMIJA, PhD, Scientific Associate, Ana VULIĆ, PhD, Senior Scientific Associate, Tina LEŠIĆ, PhD, Postdoc Student, Lidija DERGESTIN BAČUN, BSc, Expert Associate, Jelka PLEADIN, BSc. Biotehnol., PhD, Scientific Advisor with Tenure, Full Professor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia; Zrinka DUGONJIĆ ODAK, DVM, Ministry of Agriculture, Veterinary and Food Safety Directorate, Zagreb, Croatia
S orbic acid and its salts, potassium and calcium sorbate are food additives, i.e., preservatives, that have an antimicrobial, inhibitory effect on moulds and yeasts, but also on certain bacteria. Due to the above-mentioned properties, sorbic acid is widely used in the food industry, especially for the preservation of dairy products, confectionery and bakery products, mayonnaise, spreads, dried fruit, wine, and for the surface treatment of processed meat products. The mechanism of antimicrobial action of sorbate has not yet been fully elucidated. The recommended daily intake for sorbic acid is 25 mg/kg of body weight and is considered the least toxic preservative, although in combination with other additives it can create compounds harmful to human health. In order to determine possible exceedances of the maximum permissible limit (MRL) of sorbic acid in food of animal origin, over a five-year period (2018–2022), 725 samples (445 dairy and 280 meat products) were obtained from the Croatian market and analysed. Sorbic acid was detected in 37 of the 725 samples analysed. The content of sorbic acid in meat products ranged from 6–73 mg/kg and in dairy products from 6–797 mg/kg. None of the analysed samples exceeded the MRL defined by the legislation. However, in order to protect consumer health, further systematic control of this food additive is necessary.Key words: food additives; sorbic acid; sorbates dairy products; meat products