Nina Krešić¹*, Marina Prišlin¹, Dragan Brnić¹, Dunja Vlahović², Petar Kostešić³, Ivana Ljolje⁴
¹Hrvatski veterinarski institut, Odjel za virologiju, Savska cesta 143, 10 000 Zagreb, (lemo@veinst.hr), ²Veterinarski Fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za veterinarsku patologiju, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, ³Veterinarski Fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Klinika za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, ⁴Veterinarska ambulanta BUBA, Dore Pfanove 5, 10 000 Zagreb, Hrvatska

Sažetak Uvod Projekt istraživanja osobine in vitro kultiviranih matičnih stanica iz masnoga tkiva životinja i ljudiLiteraturaAbstract
Izvor: Zbornik radova Veterinarski dani, Vodice, 2021.
Sažetak
P orastom uloge psa, kao čovjekova ljubimca, raste potreba da mu se pruže najnoviji i najsigurniji, trenutno dostupni, medicinski tretmani. Temeljna i primijenjena istraživanja psećih matičnih stanica pružaju nove spoznaje o njihovim svojstvima te će omogućiti sigurnu i učinkovitu terapiju za različita stanja. Otkrićem matičnih stanica u masnom tkivu raste njihov potencijal kao terapeutika. Budući da terapija matičnim stanicama uključuje staničnu manipulaciju i in vitro kultivaciju, potrebno je istražiti njezin utjecaj na ekspresiju gena i specifičnih površinskih biljega, sastav sekretoma, a posljedično i na poželjna terapijska svojstva matičnih stanica. Istraživanja ovakovog tipa provode se na ljudskim matičnim stanicama, dok broj sličnih studija na matičnim stanicama pasa znatno manji. Od 2020. godine u tijeku je Uspostavni istraživački projekt Hrvatske zaklade za znanost UIP2019-04-2178 SECRET u okviru kojega istražujemo transkriptom i sekretom psećih mezenhimskih matičnih stanica iz masnoga tkiva sa svrhom njihove detaljne karakterizacije tijekom in vitro kultivacije, ali i nakon izlaganja uzročnicima virusnih infekcija. Iako se matične stanice vezuje uz regenerativnu medicinu i eksperimentalnu terapiju, integracijom virusa u istraživanja matičnih stanica i obratno primjenjujemo izmijenjen pristup istraživanju osobina matičnih stanica, ali i virusne borbe tijekom infekcije in vitro.
Ovakvim pristupom doprinosimo karakterizaciji matičnih stanica kao moćnog lijeka, otkrivamo odgovore na infektivne uzročnike i istovremeno pružamo novu okolinu za
otkrivanje virusnih mehanizama za adaptaciju.
Ključne riječi: matične stanice, in vitro kultivacija, terapija, regenerativna medicina, genska ekspresija
Uvod
Iako su matične stanice nazočne u mnogim tkivima, masno tkivo posjeduje izvjesne prednosti, u odnosu na druga tkiva, zato što je broj izoliranih matičnih stanica velik i stoga što je dovoljan maleni uzorak tkiva za njihovu izolaciju (KERN i sur., 2006.).
Visceralno masno tkivo kod pasa, ali i drugih vrsta je relativno jednostavno uzorkovati u okviru elektivnih kirurških zahvata. Uzorak masti za izdvajanje matičnih stanica može biti podrijetlom i iz potkožja. U humanoj medicini koristi se i lipoaspirat dobiven liposukcijom, zahvatom kojega pacijenti dobro podnose.
Ostatni uzorci masnog tkiva nakon elektivnih zahvata na kućnim ljubimcima se mogu koristiti za izdvajanje i bankiranje mezenhimskih matičnih stanica. Značaj ovakvog pristupa je i u izbjegavanju podvrgavanja životinja invazivnim zahvatima isključivo u svrhu istraživanja.
No, put od izdvajanja stanica do korištenja u terapijske svrhe nije tako jednostavan zbog nekoliko čimbenika.
Brojna istraživanja koja se provode na izdvojenim matičnim stanicama su pokazala da stanice koje zadovoljavaju kriterije Međunarodnog društva za staničnu terapiju imaju heterogena fenotipska obilježja i funkcionalnosti, na koje su utjecali uvjeti kultivacije in vitro (BARILANI i sur., 2018.).
Cilj uspješne ekspanzije in vitro je zadržati fenotip matičnih stanica i svojstvo samoobnavljanja, te podvrgnuti stanice opsežnoj proliferaciji uz zadržavanje potencijala diferencijacije u različite linije (GHARIBI i sur., 2012.).
Jedan od otegotnih čimbenika je nedostatak standardiziranih uvjeta izolacije i kultivacije između mnogobrojnih laboratorija. Unatoč tomu, izolirane stanice umnažane in vitro primijenjene su u pretkliničkim i kliničkim studijama na životinjama s promjenjivim, ali uglavnom pozitivnim rezultatima (GUGJOO i sur. 2019.). Daljnja intenzivna istraživanja svojstava stanica kultiviranih in vitro su svakako potrebna.
In vitro manipulacija također utječe na ekspresiju karakterističnih membranskih markera mezenhimskih matičnih stanica koji se koriste kako bi se potvrdio identitet izoliranih stanica (KREŠIĆ i sur. 2021.). Dodatno, in vitro ekspresija nekih markera MSC –a ne korelira uvijek s njihovim obrascima ekspresije in vivo (TAN i sur., 2019.).
Važnost spomenutih markera MSC -a je promicanje rasta, proliferacije, diferencijacije i preživljavanja stanica u staništu matičnih stanica. Praćenjem promjena u njihovoj ekpresiju tijekom in vitro kultivacije možemo predvidjeti potencijalni utjecaj kultivacijskih uvjeta na funkcije stanice te procijeniti vremenski period unutar kojega stanice kultivirane in vitro imaju optimalan imunofenotip (KREŠIĆ i sur. 2021.).
Projekt istraživanja osobine in vitro kultiviranih matičnih stanica iz masnoga tkiva životinja i ljudi
Iako se matične stanice vezuje uz regenerativnu medicinu i eksperimentalnu terapiju, smatramo da bi se integracijom virusa u istraživanja matičnih stanica i obratno primjenio moderan pristup otkrivanju ponašanja stanice i virusne borbe tijekom infekcije in vitro.
To će osigurati i holistički pristup istraživanju AD-MSCs u smislu otkrivanja profila AD-MSCs in vitro prije i nakon izlaganja uzročnicima infekcije. Stoga, doprinos SECRET projekta bit će dvojak:
1. regenerativnoj medicini i istraživanju matičnih stanica i
2. virusologiji i istraživanju virusa, a ogleda se u:
-
a) unaprijeđenju istraživanja matičnih stanica u Hrvatskoj,
b) holističkom pristupu karakterizaciji matičnih stanica kao lijeka,
c) iskorištavaju matičnih stanica kao istraživačkog alata za proučavanje staničnog odgovora na virusnu infekciju,
d) doprinosu istraživanju adaptacijiskih mehanizama virusa u novom okruženju.
Ovim predavanjem prikazat ćemo svrhu i ciljeve SECRET projekta, te dosadašnje rezultate istraživanja SECRET projekta o utjecaju kultivacije in vitro na imunofenotip potencijalnog terapeutika sa sveobuhvatnim uvidom u dinamiku ekspresije površinskih proteina koja bi mogla utjecati na terapijska svojstva matičnih stanica. Istraživanjima koja provodimo na matičnim stanicama pasa doprinosimo boljoj karakterizaciji potencijalnog terapeutika, a time i pružanju najboljih i najnovijih medicinskih tretmana za kućne ljubimce.
Literatura [… prikaži]
The effect of in vitro cultivation on the properties of stem cells isolated from canine adipose tissue
Nina Krešić, Marina Prišlin, Dragan Brnić, Dunja Vlahović, Petar Kostešić, Ivana Ljolje
T he role of the dog, as a human pet, is on the rise, and also the need to provide him with the latest and safest medical treatments currently available. Therefore, research, basic and applied, on canine stem cells is essential because it will provide new insights into their properties and will lay the foundation for safe and effective therapy for various conditions. After the discovery of stem cells in adipose tissue, their potential as a therapeutic grows. Since stem cell therapy involves cell manipulation and in vitro cultivation, it inevitably influence stem cell characteristics, gene and specific surface markers expression, secretome composition, and consequently desirable therapeutic properties of stem cells. The influence of cultivation on phenotype changes and gene expression has been the subject of research on human stem cells, but few similar studies on canine stem cells have been performed. Since 2020, the Installation Research Project of the Croatian Science Foundation UIP2019-04-2178 SECRET is underway, which explores transcriptome and secretome of canine mesenchymal stem cells from adipose tissue with the purpose of their detailed characterization during in vitro cultivation, but also after exposure to viral pathogens. Although stem cells are associated with regenerative medicine and experimental therapy, by integrating the virus into stem cell research and vice versa, we apply the different approach to research stem cell properties, but also viral struggle during infection course in vitro.
This approach contributes to the characterization of canine adipose derived stem cells as a potent drug, detects their responses to infectious agents, and at the same time provides a new environment for detecting viral mechanisms of adaptation.
Key words: stem cells, in vitro cultivation, therapy, regenerative medicine, gene expression