Snježana Zrnčić, D. Oraić, Jelka Pleadin, Ž. Mihaljević i I. Cvitić
Dr. sc. Snježana ZRNČIĆ, dr. med. vet., znanstvena savjetnica, dr. sc. Dražen ORAIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, dr. sc. Jelka PLEADIN, dipl. ing. biotehnol., docentica, znanstvena savjetnica, dr. sc. Željko MIHALJEVIĆ, dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb; Igor CVITIĆ, voditelj uzgajališta Friškina d.o.o.
UvodMaterijal i metodeRezultatiRaspravaZahvalaSažetakLiteraturaAbstract
Uvod
Kavezni uzgoj lubina i komarče je ekonomski najdohodovnija grana akvakulture u Hrvatskoj. Jednako kao i u intenzivnoj proizvodnji drugih animalnih vrsta, bolesti predstavljaju kritičnu točku i prouzroče znatne i opetovane gubitke. Vibrioza prouzročena gram negativnom bakterijom Vibrio (Listonella) anguillarum serotip O1 jedna je od najznačajnijih bakterijskih bolesti uzgajanog lubina u Hrvatskoj i ostalim mediteranskim zemljama (Le Breton, 1996., Oraić i sur., 1996., Toranzo, 2004.).
Bolest je karakterizirana hemoragičnom septikemijom i izaziva mortalitete koji dosežu do 50% oboljele populacije.
Uzročnik može preživjeti u morskom okolišu 50 mjeseci (Yiagnisis, 2006.) pa bolest ima endemski karakter, i da bi se kontrolirali gubici u proizvodnji nužno je liječenje antibioticima.Na hrvatskim uzgajalištima lubina, bolest se obično javlja u proljeće kada temperatura mora naglo raste, ujesen pri naglom padu temperature, a posljednjih nekoliko godina velike gubitke nanosi kronični oblik vibrioze kompliciran infekcijom gram negativnom bakterijom Tenacibaculum maritimum krajem zime (Zrnčić i Oraić, 2013.). Čak i uz provođenje liječenja gubitci se penju na 10 do 20% zahvaćene populacije, a štete prouzročene bolešću povećavaju troškovi liječenja, slabija konverzija hrane i zaostajanje u rastu (Sawyer i Strout, 1977., Zrnčić, 1999.) i posljedični negativan utjecaj na tržišnu kvalitetu ribe (Salte i sur., 1994.). Sporadično se gubitci u uzgoju povećavaju epidemijama pastereloze prouzročenim gram negativnom bakterijom Photobacterium damselae subsp. piscicida ujesen, a pojavi bolesti prethode ljeta s dugotrajno visokim temperaturama mora (Oraić i sur., 1998.).
Razvoj moderne akvakulture nameće implementaciju programa prevencije bolesti temeljene na stimulaciji imunosnog sustava, u tehnologiju uzgoja riba (Gudding i Van Muiswinkel, 2013.). Cijepljenjem lubina pripravkom protiv vibrioze i pastereloze koja sadrži inaktivirane uzročnike postiže se dobra zaštita od ovih dviju bolesti i cijepljenje je prihvaćeno kao jedna od mjera biosigurnosti na mnogim uzgajalištima lubina u Mediteranu (Santos i sur., 1991., Graveningen i sur., 1998.).
Vrlo učinkovita zaštita od vibrioze temelji se na programu koji započinje cijepljenjem mlađa lubina mase 1-2 grama uranjanjem u mrijestilištu. Takav tretman rezultira dobrom zaštitom u trajanju od 2 do 4 mjeseca (Wardle, 1996.) sa stupnjem zaštite 60-80%. Da bi se stupanj i vrijeme trajanja zaštite poboljšali, primjenjuje se docjepljivanje lubina u kavezima (Toranzo i sur., 2009.). Docjepljivanje se može provoditi uranjanjem, parenteralnom (i/p) aplikacijom cjepiva te primjenom cjepiva u hrani (Le Breton, 2009.), ovisno o uvjetima uzgoja, veličini ribe i mogućnostima primjene. Svaka od metoda ima prednosti i nedostatke, ali općenito se smatra da se i/p docjepljivanjem postiže najduže trajanje imunosti. Međutim, za provođenje postupka potrebna je skupa oprema i stručno osposobljeno osoblje.
S obzirom da na većinu hrvatskih uzgajališta mlađ lubina dolazi iz različitih hrvatskih i inozemnih mrijestilišta, gdje je cijepljenje mlađa protiv vibrioze uobičajen tehnološki postupak, cilj ovog istraživanja je bio provjeriti učinkovitost docjepljivanja mlađa lubina protiv vibrioze i pastereloze metodom uranjanja na uzgajalištu tijekom godine dana uzgoja.
Materijal i metode
Opis eksperimentalnog uzgajališta
Uzgajalište lubina i komarče, na kojem je provedeno istraživanje, je manje uzgajalište smješteno u uvali zaštićenoj od svih vjetrova, osim zapadnog, a riba se uzgaja u kavezima različitih oblika i kapaciteta. Epidemiološka povijest na uzgajalištu je dosta nepovoljna s obzirom da se kavezi nalaze na otprilike istim pozicijama već dvadeset godina te su tijekom proteklih godina zabilježene pojave vibrioze svake godine, a povremeno i pastereloze. Najteži oblici vibrioze bilježeni su u nekoliko proteklih uzgojnih sezona krajem zime, kada je primarna infekcija bila komplicirana s infekcijom T. maritimum, uz vrlo visoki udio mortaliteta.
Riba za pokuse
Pokusno je cijepljen mlađ lubina podrijetlom iz hrvatskog mrijestilišta izmriješten 14. prosinca 2011. Prvo cijepljenje mlađa protiv vibrioze provedeno je uranjanjem u mrijestilištu 03. travnja 2012. kada je mlađ bio u dobi od 111 dana, uz prosječnu tjelesnu težinu od 1,4 grama.
Dvadesetak dana nakon cijepljenja mlađ je dopremljen u kavez na uzgajalište.
Tijekom svibnja iste godine je obolio od infekcije T. maritimum i provedeno je liječenje florfenikolom. Sredinom lipnja uočena je invazija parazitom Ceratothoe oestroides te je provedena antiparazitarna kupka deltametrinom.
U veljači 2013. uočen je povišen mortalitet, provedena je razudba i bakteriološka pretraga te je u kontrolnoj skupini dijagnosticirana vibrioza (V. anguillarum) uz koinfekciju T. maritimum, a u cijepljenoj skupini samo infekcija T. maritimum. Provedeno je liječenje kontrolne skupine flumekvinom tijekom 10 dana početkom ožujka, a zatim je istovjetno liječenje ponovljeno u travnju 2013.
Postupak docjepljivanja
Za pokus je korišteno cjepivo ALPHA DIP 2000 (Pharmaq, Norveška), cjepivni pripravak za uranjanje koji sadrži suspenziju formalinom ubijene bakterije Vibrio anguillarum serotip O1 i Photobacterium damsela subsp. piscicida namijenjen za cijepljenje i docjepljivanje.
Prema uputi proizvođača litra cjepiva se razrijedi s 10 litara ambijentalne vode te se tako dobije cjepivna suspenzija dostatna za cijepljenje 100 kg ribe.
Docjepljivanje je provedeno 10. kolovoza 2012. u povoljnim okolišnim uvjetima pri temperaturi mora od 23,0 °C, količini otopljenog kisika oko 5 mg/L uz zasićenje od 81%. Tjedan dana prije docjepljivanja započeo je tretman ribe mješavinom beta-glukana i manan-oligosaharida u hrani kako bi se potaknuli nespecifični obrambeni mehanizmi i postigao optimalni status organizma u trenutku manipulacije. Dva dana prije postupka prekinuta je hranidba, a dan prije kavez je podijeljen u dva dijela; jedan u koji će se smjestiti docijepljena riba, a drugi za kontrolnu skupinu. Neposredno prije docjepljivanja smanjen je volumen kaveza podizanjem mreže, oko kaveza je navučena cerada i riba je blago sedirana niskim dozama benzokaina. Izlovljavane su manje količine ribe, anestezirane uranjanjem u benzokain, a kada bi se umirile, docjepljivane su uranjanjem u otopinu cjepivnog pripravka tijekom 30 sekundi. Nakon provedenog postupka, riba je vagana kako bi se odredila količina docjepljivane ribe u pripremljenoj količini cjepiva. Docjepljivana riba smještena je u novi kavez na buđenje. Tijekom cijelog postupka mjerena je koncentracija kisika u kavezu sa sediranom ribom i u trenutku kada se zasićenje spustilo ispod 80% dodavan je kisik.
Kontrola parametara rasta i preživljavanja
Neposredno prije pokusa uzorkovano je 50 primjeraka lubina i izmjerena im je duljina, težina i određen Fultonov indeks kondicije (KI) (Ricker, 1975.). Isti je postupak ponavljan na 30 primjeraka, mjesečno, tijekom 4 mjeseca nakon cijepljenja, a redovito su bilježeni podatci o temperaturi mora i mortalitetima.
Kontrola parametara rasta provedena je i prilikom uzorkovanja krvi za određivanje IgM. Godinu dana nakon docjepljivanja izražen je RPP (relativni postotak preživljavanja), izračunat prema sljedećoj formuli: RPP=1 – (% mortaliteta u pokusnoj skupini/% mortaliteta u kontrolnoj skupini) x 100 (Amend, 1981.).
Određivanje količine IgM u serumu
U lipnju 2013. godine uzorkovana je krv punkcijom kaudalne vene od po 10 primjeraka iz docjepljene skupine i kontrolne skupine. Uzorci su ostavljeni preko noći na +4 °C da se odvoje korpuskularni elementi te su odvojeni serumi centrifugirani u centrifugi s hlađenjem na 1000 g/min tijekom 15 minuta. Izdvojeni serumi pretraženi su primjenom komercijalnog imunoenzimskog testa (ELISA) za kvantitativno određivanje IgM u serumu riba, prema uputi proizvođača (Cusabio, Kina), s mogućnošću detektiranja u rasponu od 2 μg/mL do 50 μg/mL IgM.
Statistička analiza
Distribucija prikupljenih podataka testirana je Shapiro-Wilk W testom.
Nakon testiranja distribucije, u analizi statističke povezanosti, korištena je multivarijabilna regresijska analiza.
Ukoliko distribucija podataka nije bila normalna, korišten je neparametrijski Spaerman korelacijski test. Statističke analize provedene su uporabom Stata 10.0 programa (StataCorp. 2005 Stata Statistical Software: Release 10.0, College Station, TX, SAD). Razina statističke značajnosti od p<0,05 je prihvaćena kao značajna.
Rezultati
Pokusno cijepljeni mlađ lubina bio je dugačak 14,12±1,15 cm, težio je 29,86±6,99 g i imao indeks kondicije 1,04±0,07.
Razlike u prirastu u duljini i težini između cijepljene i necijepljene skupine nisu bile značajne tijekom prva četiri mjeseca, što je vidljivo u Tabeli 1.
Mortaliteti su jedino u prvom mjesecu nakon cijepljenja bili viši u cijepljenom od necijepljenog kaveza, što je uočljivo iz Tabele 2. i Grafa 1.
docjepljivanoj i kontrolnoj skupini
docjepljivane i kontrolne skupine
U docjepljenoj skupini izmjerene su prosječne vrijednosti IgM od 4,42±1,93 μg/mL, a u kontrolnoj je skupini izmjerena prosječna vrijednost IgM od 2,22±0,29 μg/mL (Graf 2).
Rasprava
Dugi niz godina su epidemije vibrioze na hrvatskim uzgajalištima lubina manje ili više uspješno liječene primjenom antibakterijskih lijekova. No, posljednjih su nekoliko godina zabilježeni ozbiljni gubitci od kronične vibrioze komplicirani koinfekcijom T. maritimum krajem zime.
U to doba godine, s obzirom na niske temperature mora od ≥ 12 °C, riba slabo uzima hranu, a antibakterijsko liječenje se nije pokazalo učinkovito. Osim toga, na nacionalnom tržištu ne postoji dostatan izbor lijekova registriranih za antibakterijsko liječenje riba, a zamijećena je i smanjena osjetljivost na neke lijekove. Pozitivna iskustva prevencije vibrioze cijepljenjem u mrijestilištu i docjepljivanjem na uzgajalištu u drugim mediteranskim zemljama (Le Breton, 2009.), ukazuju da je takav postupak optimalna opcija upravljanja zdravljem lubina u uzgoju.
Rezultati pokusa provedenog u uzgojnim uvjetima pokazuju visoku učinkovitost docjepljivanja mlađa lubina uranjanjem izraženu višim preživljavanjem docjepljivane u odnosu na skupinu koja je cijepljena samo u mrijestilištu. Jednako dobre rezultate docjepljivanja uranjanjem su u laboratorijskim uvjetima u Grčkoj postigli Angelidis i sur. (2006.), koji su učinkovitost cijepljenja i docjepljivanja provjeravali izazivačkom infekcijom bakterijom V. anguillarum.
U našem istraživanju 6 mjeseci nakon docjepljivanja na uzgajalištu je izbila vibrioza. Na taj je način učinkovitost docjepljivanja provjerena „prirodnom izazivačkom infekcijom“. Za procjenu učinkovitosti postupka uzeti su u obzir svi mortaliteti tijekom godine dana nakon provedenog docjepljivanja. Ove činjenice objašnjavaju razliku u RPP koji je u našem pokusu iznosio 75%, za razliku od laboratorijskog pokusa u Grčkoj gdje je izazivačka infekcija provedena i/p aplikacijom bakterije, a RPP je dva tjedna kasnije iznosio 93% kod primarno cijepljene, odnosno 100% kod docjepljene ribe. Slične su rezultate, nakon izazivačke infekcije cijepljenog i docjepljenog lubina u laboratorijskim uvjetima, postigli Galeotti i sur. (2013.). Međutim, prema Europskoj farmakopeji RPP viši od 70% nakon i/p cijepljenja, odnosno viši od 60% nakon cijepljenja uranjanjem, smatraju se zadovoljavajućim i označavaju učinkovito cjepivo (EU, EDQM, 2013.). Bitno je naglasiti da je RPP od 75% postignut u uzgojnim uvjetima i u razdoblju tijekom godina nakon provođenja docjepljivanja.
Uzgojni rezultati, praćeni kroz udio preživljavanja, prirast i izmjerenu količinu IgM u docjepljivanoj i kontrolnoj skupini ovog pokusa, pokazuju učinkovitost docjepljivanja uranjanjem mlađa lubina na uzgajalištu u svim navedenim parametrima. Razlika u broju preživjelih jedinki je znatna; 95% u docjepljivanoj, u odnosu na 80% u kontrolnoj skupini.
Preživljavanje i činjenica da nije bilo potrebno primjeniti antimikrobnu terapiju tijekom prirodne infekcije dokazuju ekonomsku opravdanost primjene docjepljivanja. Prirast je u cijepljenoj skupini bio jedva nešto veći (244±9,8 cm, 160,7±71 g, KI 1,1±0,07), granične signifikantnosti u odnosnu na kontrolnu (236,24±10,9 cm, 140,47±13,6 g, KI 1,07±0,07). Međutim, vrlo je vjerojatno da je jednak prirast u kontrolnoj skupini prouzročen većim prostorom uzgoja ribe, odnosno manjom gustoćom, s obzirom da je u kontrolnoj skupini preživljavanje bilo 15% manje nego u cijepljenoj.
Deset mjeseci nakon docjepljivanja u serumu docjepljenih riba izmjerena je gotovo dvostruko veća količina IgM (4,42±1,93 μg/mL) u odnosu na ribu iz kontrolne skupine (2,22±0,29 μg/mL). Ovi podatci dokazuju da je ovako pobuđen humoralni imunitet dugotrajan, a dobiveni rezultati su sukladni s rezultatima sličnog pokusa provedenog u lubina uzgajanih u bazenima i kavezima na Sardiniji (Viale i sur., 2006.).
Autori su pratili uzgojne rezultate i protutijela u serumu lubina docjepljenih protiv vibrioze godinu dana nakon docjepljivanja i zaključili da je prednost u preživljavanju i titru protutijela u serumu 10% veća u docjepljene ribe.
Provedeno pokusno docjepljivanje na uzgajalištu upućuje na zaključak da je takav postupak ekonomski opravdan i da pruža zaštitu od učestalih reinfekcija bakterijom V. anguillarum. S obzirom da tijekom razdoblja praćenja docjepljene ribe nije bilo prirodne infekcije Photobacterium damselae subsp. piscicida, nije bila moguća evaluacija učinkovitosti druge komponente ispitivanog cijepivnog pripravka.
Posljednjih dvadesetak godina brojni su primjeri opravdanosti cijepljenja ribe u svjetlu održivog rasta, razvoja i isplativosti akvakulture (Thorarinsson i Powell, 2006.).
Kod riba zaštićenih cjepivom tijekom cijelog uzgojnog ciklusa će gubitci od bakterijskih bolesti i potreba liječenja biti svedeni na minimum. Cijepljenje će imati povoljan ekonomski učinak na profitabilnost i stoga bi postupak docjepljivanja trebalo svakako uključiti u proizvodni proces uzgoja lubina.
Zahvala
Autori zahvaljuju tvrtki Pharmaq, Norveška za ustupljeno cjepivo ALPHA DIP 2000 i gosp. Draganu Pezelju, vlasniku uzgajališta Friškina d.o.o. što nam je omogućio provođenje pokusa.
Sažetak
Marikultura je kroz uzgoj lubina i komarče najzastupljenija grana akvakulture u Hrvatskoj. Bolesti predstavljaju kritičnu točku u proizvodnji, a najučestalije su pojave vibrioze prouzročene bakterijom Vibrio anguillarum serotip O1 i pastereloze prouzročene bakterijom Photobacterium damselae subsp. piscicida. S ciljem poboljšanja proizvodnih rezultata u uzgoju lubina provedeno je pokusno docjepljivanje, uranjanjem, protiv ovih dvaju bakterijskih uzročnika u uzgojnim uvjetima. Tijekom godine dana praćeni su okolišni uvjeti, parametri rasta te je određena količina IgM u serumu docjepljivanih lubina i onih kontrolne skupine. Rezultati su pokazali preživljavanje u docjepljivanoj skupini 95% za razliku od 80% u kontrolnoj skupini, a relativni postotak preživljavanja (RPP) je bio 75%. Razina IgM u serumu lubina je deset mjeseci nakon docjepljivanja bila dvostruko veća u docjepljene skupine (4,42±1,93 μg/mL) za razliku od kontrolne skupine (2,22±0,29 μg/mL).
Pokusno docjepljivanje ukazuje na ekonomsku opravdanost uvođenja postupka docjepljivanja u tehnologiju uzgoja kao jednu od važnih mjera biosigurnosti.
vrh ↑
Literatura [… prikaži]
Effectiveness of revaccination of sea bass (Dicentrarchus labrax) in farm conditions
Snježana ZRNČIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Dražen ORAIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Jelka PLEADIN, BSc, PhD, Assistant Professor, Željko MIHALJEVIĆ, DVM, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb; Igor CVITIĆ, Fishery’s Manager, Friškina d.o.o.
Economically, the cultivation of sea bass and sea bream is the most important mariculture activity in Croatian aquaculture. Critical points during cultivation are disease outbreaks, namely vibriosis caused by the bacterium Vibrio anguillarum serotype O1, and pasteurellosis caused by Photobacterium damselae subsp. piscicida, which occur often. The aim of this study was to improve the production results in sea bass cultivation by means of experimental revaccination against these bacterial diseases. Environmental conditions, growth parameters and serum levels of IgM of revaccinated and control groups were measured during twelve months after revaccination. Results of the experiment showed that the relative percentage of survival (RPS) was 75%. IgM measured in the serum of revaccinated sea bass sera was twice as high (4.42±1.93 μg/mL) as in the control group (2.22±0.29 μg/mL) ten months later. Revaccination of sea bass should be implemented into the cultivation process at farms as a biosecurity measure due to its cost-effectiveness.
