Nina Vukušić i Nevijo Zdolec*
Nina VUKUŠIĆ, dr. med. vet., Zagreb, Hrvatska; dr. sc. Nevijo ZDOLEC*, dr. med. vet., (dopisni autor, e-mail: nzdolec@vef.hr), izvanredni profesor, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska
Sažetak
E nterokoki imaju važnu ulogu u fermentaciji hrane te često pokazuju probiotička svojstva. U ovom radu istražen je njihov antimikrobni učinak in vitro prema referentnim sojevima i sojevima izoliranih iz hrane bakterija Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica i Salmonella Typhimurium. Korištena je agar difuzijska metoda, a nadtalozi neutralizirani i tretirani proteazom. Enterococcus faecalis EF-101 je pokazao snažno inhibicijsko djelovanje prema svim sojevima bakterije roda Listeria, kao i soja Y. enterocolitica O:3.
Karakterizacijom inhibitora ustvrđeno je da se radi o tvari proteinske strukture, moguće bakteriocina enterocina čija je aktivnost bila 1280 AU/mL. Potrebna su daljnja istraživanja radi potencijalne primjene enterocina kao prirodnog konzervansa u očuvanju održivosti i povećanja mikrobiološke sigurnosti hrane.
Ključne riječi: enterocin, patogene bakterije, hrana životinjskog podrijetla
Uvod
Njihovi su bakteriocini iz II skupine bakteriocina koje smatramo malim, toplinski stabilnim i membranski aktivnim peptidima (van Belkum i Stiles, 2000.). Enterocini su opisani kao antimikrobni peptidi aktivni protiv nekih usko povezanih bakterija mliječne kiseline, Listeria monocytogenes, Clostridium spp., Staphylococcus aureus i stoga pokazuju potencijal u unaprjeđenjusigur nosti hrane (Giraffa, 1995.). Mogu se primjenjivati u hrani kao svojevrsni aditivi, tj. dodatci ili putem bakteriocinogenih sojeva direktno u prehrambenom lancu.
Također se ispituje primjenjivost enterokoka kao starter kultura koje sintetiziraju bakteriocine, no tu je nužna potpuna karakterizacija sojeva s obzirom na potencijalna rizična svojstva (Zdolec i sur., 2017.).
U tom smislu moraju zadovoljiti kriterije sigurnosti poput izostanka virulentnih faktora, prenosivih gena rezistencije ili dekarboksilacijske aktivnosti (Zdolec, 2018.).
Pojedini sojevi E. faecalis i E. faecium ne pokazuju virulentna svojstva, ne tvore biogene amine niti su otporni na antibiotike pa ih to čini potencijalno primjenjivima u fermentiranim proizvodi-ma (Calewaert i sur., 2000.). Zabilježeno je da i njihovi bakteriocini snažno inhibiraju pojedine patogene bakterije u hrani životinjskog podrijetla. Tako su Ananou i sur. (2004.) upotrijebili enterocin AS-48 iz E. faecalis s ciljem inhibiranja rasta enterotoksičnih sojeva S. aureus. Autori su kombinirali metode čuvanja hrane i dodali enterocin na 4 °C, zajedno s povećanom koncentracijom NaCl (6-7 %) i time dobili željene rezultate. Ennahar i Deschamps (2000.) zapazili su visoku aktivnost enterocina A iz E. faecium na 13 sojeva L. monocytogenes. Aymerich i sur. (2000.) su demonstrirali učinkovitost enterocina A i B u kontroli L. innocua u raznim mesnim proizvodima (kuhana šunka, pašteta, fermentirani proizvodi).
Poznato je da bakteriocini bakterija mliječne kiseline djeluju na Gram-pozitivne bakterije, dok djelovanje na Gram-negativne nije uobičajeno najvjerojatnije zbog složenije strukture njihove stanične membrane koja je nepropusna za većinu makromolekula i hidrofobnih supstanci (Vesković-Moračanin, 2010.). Cilj je ovog rada bio ispitati učinak odabranih sojeva enterokoka iz hrane životinjskog podrijetla na neke od patogenih bakterija važnih u veterinarskom javnom zdravstvu, uključujući L. monocytogenes, Y. enterocolitica i Salmonella Typhimurium.
Materijali i metode
Izolati enterokoka
Priprema sojeva za ispitivanje antimikrobne aktivnosti
Nakon pripreme ploča s indikatorskim mikroorganizmom, u agaru su načinjene jažice u koje se stavlja 100 μL nadtaloga. Kako bi se isključilo antimikrobno djelovanje kiselina, pH nadtaloga je neutraliziran na pH 7 pomoću 1N NaOH. Po nanošenju nadtaloga u jažice, ploče su stavljene u hladnjak na 60 min. te potom inkubirane na 37 °C tijekom 24 sata. Nakon inkubacije provjerena je pojava zone inhibicije rasta indikatorskog mikroorganizma. Istovremena pojava inhibicije rasta indikatorske bakterije oko jažice s nadtalogom te oko jažice s neutraliziranim nadtalogom smatra se preliminarnim dokazom djelovanja antimikrobne tvari koja nije organska kiselina (mliječna, octena i dr.).
Proteinska struktura inhibitora provjerena je pomoću enzima proteinaze K (Sigma Aldrich, SAD). U slučaju pojave inhibicije neutraliziranim nadtalogom i potom izostanka inhibicije neutraliziranim nadtalogom tretiranog proteazom, govorimo o djelovanju bakteriocina ili bakteriocin-sličnoj tvari.
Antimikrobna aktivnost enterokoka ispitana je prema sljedećim bakterijama: Listeria monocytogenes 8 (izolat iz sirovog mlijeka), Yersinia enterocolitica 14 (izolat iz tonzila divljih svinja), L. monocytogenes NCTC 10527, L. monocytogenes ATCC 7644, Listeria ivanovii ATCC 19111, Listeria innocua ATCC 33090, Salmonella Typhimurium ATCC 14028.
Mjerenje aktivnosti bakteriocina
Ona je jednaka recipročnoj vrijednosti najvećeg razrjeđenja u kojem se pojavljuje inhibicija indikatorske bakterije i izražava se u AU/mL (arbitrarne jedinice/mL).
Rezultati i rasprava
U našem istraživanju pokazalo se da enterokoki djeluju inhibirajuće na sojeve bakterije L. monocytogenes, L. ivanovii i L. innocua te Y. enterocolitica. Antimikrobno djelovanje na sojeve iz roda Listeria zabilježeno je i nakon neutraliziranja nadtaloga kulture E. faecalis EF-101, što može biti rezultat djelovanja bakteriocina – enterocina. Proteinska struktura inhibitora je i potvrđena primjenom proteinaze K, što se smatra dokazom postojanja bakteriocina u otopini (nadtalogu). Agar-difuzijskim testom nakon razrjeđivanja nadtaloga kulture E. faecalis EF-101 u našem istraživanju je zabilježena inhibicija L. monocytogenes u razrjeđenju 1:128, primjenom netretiranog i neutraliziranog taloga. Aktivnost enterocina u zadanim uvjetima pripreme otopine je zadovoljavajuća te je potrebno dodatno ispitati sintezu bakteriocina u različitim uvjetima temperature, pH i dr. kao i njegovu stabilnost. Crk i Zdolec (2018.) navode da Enterococcus faecalis EF-101 pokazuje u agar spot i agar difuzijskim testovima inhibicijsko djelovanje prema šest izolata L. monocytogenes iz uzoraka hrane životinjskog podrijetla. Autori su istovremenom inokulacijom E. faecalis EF-101 i L. monocytogenes ATCC 7644 u BHI/MRS tekućim hranilištima dokazali evidentno smanjenje populacije patogena u odnosu na tekuća hranilišta bez E. faecalis. Pored toga, primjena nadtaloga (neutraliziran nadtalog bez stanica) dovela je do još izraženijeg smanjenja broja L. monocytogenes u oba tekuća hranilišta.
Kako smo ranije naveli, bakteriocini bakterija mliječne kiseline mogu biti aktivni samo protiv srodnih Gram-pozitivnih bakterija (Jack i sur., 1995.).
U našem istraživanju inhibirane su bile upravo Gram-pozitivne bakterije, dok je inhibicija izostala u slučaju salmonele.
Međutim, značajan je naš nalaz inhibicije Y. enterocolitica i u odsustvu organskih kiselina, što je potrebno dalje istražiti radi potvrde učinka djelovanja enterocina iz E. faecalis EF-101 i na druge Gram-negativne bakterije. Ukupno gledajući, slične rezultate pokazuju Kubašová i sur. (2017.) koji nalaze samo dva soja enterokoka (E. faecium IK25 i E. faecium BRI) s antimikrobnom aktivnosti prema indikatorskim bakterijama i to samo prema E. faecium, Listeria monocytogenes i Lactobacillus spp., dok inhibicije nije bilo prema Bacillus sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Serratia sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., i Yersinia sp. Osim u laboratorijskim uvjetima, antimikrobni učinak enterokoka ispitivan je mnogo puta i u pokusnim proizvodnjama hrane gdje se inhibira L. monocytogenes (Rubio i sur., 2013.) ili stafilokoki (Sparo i sur., 2008.).
Naše istraživanje, uz prije provedene eksperimente na ovom soju (Zdolec i sur., 2017., Crk i Zdolec, 2018.) proširuje saznanja o njegovoj antimikrobnoj aktivnosti s obzirom na antimikrobni spektar te proteinsku strukturu inhibitora. Primjenjivost enterocina iz E. faecalis EF-101 u proizvodnji hrane ili animalnoj proizvodnji moguća je nakon daljnjih istraživanja.
Zahvala
Literatura [… prikaži]
The effect of enterococcal bacteriocins on selected foodborne pathogens
Nina VUKUŠIĆ, DVM, Zagreb, Croatia; Nevijo ZDOLEC, DVM, PhD, Associate Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia
E nterococci have an important role in food fermentation and often exhibit probiotic properties. In this paper, their antimicrobial eff ect was investigated in vitro against the following reference strains and strains isolated from food: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica and Salmonella Typhimurium.
The agar diffusion method was used, and the supernatants were neutralized and treated with protease. Enterococcus faecalis EF-101 showed strong inhibitory activity against all strains of Listeria as well as the Y. enterocolitica O:3 strain. The activity of the proteinaceous inhibitor was 1280 AU/mL. Further research should be carried out to assess the potential use of enterocin as a natural preservation agent in food protection.
Key words: enterocin; bacterial pathogens; food of animal origin