Utjecaj bakteriocina enterokoka na odabrane uzročnike bolesti prenosivih hranom

Nina Vukušić i Nevijo Zdolec*

Nina VUKUŠIĆ, dr. med. vet., Zagreb, Hrvatska; dr. sc. Nevijo ZDOLEC*, dr. med. vet., (dopisni autor, e-mail: nzdolec@vef.hr), izvanredni profesor, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

Prenešeno iz časopisa VETERINARSKA STANICA br. 51 (2), 2020.[download/preuzmi pdf ovdje]

Sažetak Uvod Materijali i metode Rezultati i rasprava Zahvala Literatura Abstract

▲

Sažetak

Enterokoki imaju važnu ulogu u fermentaciji hrane te često pokazuju probiotička svojstva. U ovom radu istražen je njihov antimikrobni učinak in vitro prema referentnim sojevima i sojevima izoliranih iz hrane bakterija Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica i Salmonella Typhimurium. Korištena je agar difuzijska metoda, a nadtalozi neutralizirani i tretirani proteazom. Enterococcus faecalis EF-101 je pokazao snažno inhibicijsko djelovanje prema svim sojevima bakterije roda Listeria, kao i soja Y. enterocolitica O:3.
Karakterizacijom inhibitora ustvrđeno je da se radi o tvari proteinske strukture, moguće bakteriocina enterocina čija je aktivnost bila 1280 AU/mL. Potrebna su daljnja istraživanja radi potencijalne primjene enterocina kao prirodnog konzervansa u očuvanju održivosti i povećanja mikrobiološke sigurnosti hrane.
Ključne riječi: enterocin, patogene bakterije, hrana životinjskog podrijetla

▲

Uvod

Primjena bakteriocina, antimikrobnih bakterijskih peptida, jedno je od vodećih područja znanstvenih-primjenjivih istraživanja s ciljem uvođenja prirodnih konzervanasa u proizvodnji hrane. Bakteriocini enterokoka (enterocini) mogu biti širokog ili uskog spektra djelovanja, a najznačajnije enterocin-sintetizirajuće vrste su: Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium.
Njihovi su bakteriocini iz II skupine bakteriocina koje smatramo malim, toplinski stabilnim i membranski aktivnim peptidima (van Belkum i Stiles, 2000.). Enterocini su opisani kao antimikrobni peptidi aktivni protiv nekih usko povezanih bakterija mliječne kiseline, Listeria monocytogenes, Clostridium spp., Staphylococcus aureus i stoga pokazuju potencijal u unaprjeđenjusigur nosti hrane (Giraffa, 1995.). Mogu se primjenjivati u hrani kao svojevrsni aditivi, tj. dodatci ili putem bakteriocinogenih sojeva direktno u prehrambenom lancu.

Također se ispituje primjenjivost enterokoka kao starter kultura koje sintetiziraju bakteriocine, no tu je nužna potpuna karakterizacija sojeva s obzirom na potencijalna rizična svojstva (Zdolec i sur., 2017.).
U tom smislu moraju zadovoljiti kriterije sigurnosti poput izostanka virulentnih faktora, prenosivih gena rezistencije ili dekarboksilacijske aktivnosti (Zdolec, 2018.).

Pojedini sojevi E. faecalis i E. faecium ne pokazuju virulentna svojstva, ne tvore biogene amine niti su otporni na antibiotike pa ih to čini potencijalno primjenjivima u fermentiranim proizvodi-ma (Calewaert i sur., 2000.). Zabilježeno je da i njihovi bakteriocini snažno inhibiraju pojedine patogene bakterije u hrani životinjskog podrijetla. Tako su Ananou i sur. (2004.) upotrijebili enterocin AS-48 iz E. faecalis s ciljem inhibiranja rasta enterotoksičnih sojeva S. aureus. Autori su kombinirali metode čuvanja hrane i dodali enterocin na 4 °C, zajedno s povećanom koncentracijom NaCl (6-7 %) i time dobili željene rezultate. Ennahar i Deschamps (2000.) zapazili su visoku aktivnost enterocina A iz E. faecium na 13 sojeva L. monocytogenes. Aymerich i sur. (2000.) su demonstrirali učinkovitost enterocina A i B u kontroli L. innocua u raznim mesnim proizvodima (kuhana šunka, pašteta, fermentirani proizvodi).

Poznato je da bakteriocini bakterija mliječne kiseline djeluju na Gram-pozitivne bakterije, dok djelovanje na Gram-negativne nije uobičajeno najvjerojatnije zbog složenije strukture njihove stanične membrane koja je nepropusna za većinu makromolekula i hidrofobnih supstanci (Vesković-Moračanin, 2010.). Cilj je ovog rada bio ispitati učinak odabranih sojeva enterokoka iz hrane životinjskog podrijetla na neke od patogenih bakterija važnih u veterinarskom javnom zdravstvu, uključujući L. monocytogenes, Y. enterocolitica i Salmonella Typhimurium.

▲

Materijali i metode

Izolati enterokoka

Za potrebe ovog istraživanja korišteni su izolati enterokoka iz hrane životinjskog podrijetla prikupljeni tijekom rutinskih mikrobioloških analiza. 25 grama uzoraka homogenizirano je u slanoj peptonskoj vodi te su načinjena serijska decimalna razrjeđenja iz kojih je uzeto 0,1 mL inokuluma i nasađeno na površinu Compass Enterococcus agara (Biokar, Francuska) koji je inkubiran 24 h na 44 °C. Odabrani izolati (n=10) namnažani su u De Man, Rogosa i Sharpe bujonu (MRS, Darmstadt, Merck, Njemačka) te korišteni za ispitivanja antimikrobne aktivnosti. Pored 10 izolata enterokoka, korišten je i soj Enterococcus faecalis EF-101 iz sirovog mlijeka koji je pokazao antimikrobnu aktivnost u prijašnjim istraživanjima (Zdolec i sur., 2016., Crk i Zdolec, 2018.).

Priprema sojeva za ispitivanje antimikrobne aktivnosti

Svaki pojedini izolat enterokoka namnažan je u 10 mL MRS bujona na 37 °C. Aktivna kultura (10 mL) je potom prebačena u 100 mL MRS bujona i inkubirana u istim uvjetima. Jedan mL kulture je centrifugiran na 14000 o/min tijekom 10 minuta na 4 °C. Potom je uzet nadtalog koji je korišten za ispitivanje antimikrobnog učinka. Antimikrobna aktivnost nadtaloga provjerena je agar difuzijskim testom u Brain Hearth Infusion agaru (BHI, Oxoid, Basingstoke, UK) prekrivenog s 5 mL mekog (0,7 % agara) BHI agara u koji su dodavane indikatorske bakterije. Indikatorske bakterije prethodno su namnožene u primjerenoj tekućoj podlozi; Buffered Peptone Water (BPV, Merck, Njemačka) za salmonelu, BHI za listeriju i Peptone Sorbitol Bile (PSB, Sigma Aldrich, St. Louis, SAD ) za jersiniju.

Nakon pripreme ploča s indikatorskim mikroorganizmom, u agaru su načinjene jažice u koje se stavlja 100 μL nadtaloga. Kako bi se isključilo antimikrobno djelovanje kiselina, pH nadtaloga je neutraliziran na pH 7 pomoću 1N NaOH. Po nanošenju nadtaloga u jažice, ploče su stavljene u hladnjak na 60 min. te potom inkubirane na 37 °C tijekom 24 sata. Nakon inkubacije provjerena je pojava zone inhibicije rasta indikatorskog mikroorganizma. Istovremena pojava inhibicije rasta indikatorske bakterije oko jažice s nadtalogom te oko jažice s neutraliziranim nadtalogom smatra se preliminarnim dokazom djelovanja antimikrobne tvari koja nije organska kiselina (mliječna, octena i dr.).
Proteinska struktura inhibitora provjerena je pomoću enzima proteinaze K (Sigma Aldrich, SAD). U slučaju pojave inhibicije neutraliziranim nadtalogom i potom izostanka inhibicije neutraliziranim nadtalogom tretiranog proteazom, govorimo o djelovanju bakteriocina ili bakteriocin-sličnoj tvari.

Antimikrobna aktivnost enterokoka ispitana je prema sljedećim bakterijama: Listeria monocytogenes 8 (izolat iz sirovog mlijeka), Yersinia enterocolitica 14 (izolat iz tonzila divljih svinja), L. monocytogenes NCTC 10527, L. monocytogenes ATCC 7644, Listeria ivanovii ATCC 19111, Listeria innocua ATCC 33090, Salmonella Typhimurium ATCC 14028.

Mjerenje aktivnosti bakteriocina

Priprema nadtaloga inhibirajuće kulture enterokoka provedena je prema Zdolec i sur. (2008.). Ukratko, soj enterokoka s antimikrobnom aktivnosti prema više indikatorskih bakterija namnažan je u 10 mL MRS bujona, potom je ta kultura namnažana dalje u omjeru 1:10 te je dobiveno 1 L kulture. Kultura je podijeljena u 20 jednakih dijelova po 50 mL radi centrifugiranja (Eppendorf centrifuge 5804R, Hamburg, Njemačka) 10 minuta na 5000 o/min. Centrifugiranje je ponovljeno dva puta. Nadtalog je pažljivo odvojen i prikupljen u novu sterilnu čašu (2 L). Izmjeren je pH (pH510, Eutech Instruments, Nizozemska) koji je potom podešen na pH 7 pomoću 10 N NaOH uz stalno miješanje nadtaloga. Jedan mililitar nadtaloga je steriliziran kroz filtere veličine pora 0,22 μm (FilterBio, Kina). Nakon sterilizacije otopina je razrjeđena u sterilnoj destiliranoj vodi 1:1, tj. načinjena su razrjeđenja 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024. Potom je 100 μL određenog razrjeđenja korišteno u agar difuzijskom testu s indikatorskom bakterijom kako bi se odredila koncentracija bakteriocina.
Ona je jednaka recipročnoj vrijednosti najvećeg razrjeđenja u kojem se pojavljuje inhibicija indikatorske bakterije i izražava se u AU/mL (arbitrarne jedinice/mL).

▲

Rezultati i rasprava

Rast L. monocytogenes 8 iz sirovog mlijeka inhibiralo je 7 sojeva enterokoka djelovanjem netretiranog nadtaloga (pH 5,5). Samo jedan soj je inhibirao rast L. monocytogenes ATCC 7644 i L. monocytogenes NCTC 10527, dok je inhibicija izostala nakon neutralizacije nadtaloga. E. faecalis EF-101 inhibirao je rast sva tri navedena soja L. monocytogenes i nakon neutralizacije nadtaloga (moguće djelovanjem bakteriocina). Listeria ivanovii ATCC 19111 bila je inhibirana primjenom netretiranog i neutraliziranog nadtaloga jednog soja kao i sojem EF-101, dok je soj L. innocua ATCC 33090 bio inhibiran samo primjenom E. faecalis EF-101. U pogledu Gram-negativnih bakterija, patogena Y. enterocolitica 14 (O:3 serotip) je bila inhibirana netretiranim nadtalogom jednog soja enterokoka, dok je EF-101 pokazao inhibiciju i neutralizacijom (moguć učinak enterocina). Na rast Salmonella Typhimurium ATCC 14028 nije bilo nikakvog utjecaja ispitivanih sojeva enterokoka kao ni E. faecalis EF-101. S obzirom na dobivene rezultate, soj E. faecalis EF-101 korišten je za karakterizaciju bakteriocina i određivanje njegove koncentracije postupkom serijskih razrjeđivanja uz indikator mikroorganizam L. monocytogenes NCTC 10527 (Slika 1).

petrijevke — **Slika 1.** Određivanje aktivnosti bakteriocina iz neutraliziranog nadtaloga *E. faecalis* EF-101 (snimila: Nina Vukušić).

U našem istraživanju pokazalo se da enterokoki djeluju inhibirajuće na sojeve bakterije L. monocytogenes, L. ivanovii i L. innocua te Y. enterocolitica. Antimikrobno djelovanje na sojeve iz roda Listeria zabilježeno je i nakon neutraliziranja nadtaloga kulture E. faecalis EF-101, što može biti rezultat djelovanja bakteriocina – enterocina. Proteinska struktura inhibitora je i potvrđena primjenom proteinaze K, što se smatra dokazom postojanja bakteriocina u otopini (nadtalogu). Agar-difuzijskim testom nakon razrjeđivanja nadtaloga kulture E. faecalis EF-101 u našem istraživanju je zabilježena inhibicija L. monocytogenes u razrjeđenju 1:128, primjenom netretiranog i neutraliziranog taloga. Aktivnost enterocina u zadanim uvjetima pripreme otopine je zadovoljavajuća te je potrebno dodatno ispitati sintezu bakteriocina u različitim uvjetima temperature, pH i dr. kao i njegovu stabilnost. Crk i Zdolec (2018.) navode da Enterococcus faecalis EF-101 pokazuje u agar spot i agar difuzijskim testovima inhibicijsko djelovanje prema šest izolata L. monocytogenes iz uzoraka hrane životinjskog podrijetla. Autori su istovremenom inokulacijom E. faecalis EF-101 i L. monocytogenes ATCC 7644 u BHI/MRS tekućim hranilištima dokazali evidentno smanjenje populacije patogena u odnosu na tekuća hranilišta bez E. faecalis. Pored toga, primjena nadtaloga (neutraliziran nadtalog bez stanica) dovela je do još izraženijeg smanjenja broja L. monocytogenes u oba tekuća hranilišta.

Kako smo ranije naveli, bakteriocini bakterija mliječne kiseline mogu biti aktivni samo protiv srodnih Gram-pozitivnih bakterija (Jack i sur., 1995.).
U našem istraživanju inhibirane su bile upravo Gram-pozitivne bakterije, dok je inhibicija izostala u slučaju salmonele.
Međutim, značajan je naš nalaz inhibicije Y. enterocolitica i u odsustvu organskih kiselina, što je potrebno dalje istražiti radi potvrde učinka djelovanja enterocina iz E. faecalis EF-101 i na druge Gram-negativne bakterije. Ukupno gledajući, slične rezultate pokazuju Kubašová i sur. (2017.) koji nalaze samo dva soja enterokoka (E. faecium IK25 i E. faecium BRI) s antimikrobnom aktivnosti prema indikatorskim bakterijama i to samo prema E. faecium, Listeria monocytogenes i Lactobacillus spp., dok inhibicije nije bilo prema Bacillus sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Serratia sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., i Yersinia sp. Osim u laboratorijskim uvjetima, antimikrobni učinak enterokoka ispitivan je mnogo puta i u pokusnim proizvodnjama hrane gdje se inhibira L. monocytogenes (Rubio i sur., 2013.) ili stafilokoki (Sparo i sur., 2008.).

Naše istraživanje, uz prije provedene eksperimente na ovom soju (Zdolec i sur., 2017., Crk i Zdolec, 2018.) proširuje saznanja o njegovoj antimikrobnoj aktivnosti s obzirom na antimikrobni spektar te proteinsku strukturu inhibitora. Primjenjivost enterocina iz E. faecalis EF-101 u proizvodnji hrane ili animalnoj proizvodnji moguća je nakon daljnjih istraživanja.

▲

Zahvala

Rad je izvadak iz diplomskog rada Nine Vukušić naslova „Karakterizacija bakteriocina enterokoka izoliranih iz hrane životinjskog podrijetla“ (mentor izv.prof.dr.sc. Nevijo Zdolec). Autori se zahvaljuju Ani Konjević na tehničkoj pomoći tijekom laboratorijskih analiza.

Literatura [… prikaži]

▲

1. ANANOU, S., E. VALDIVIA, M. MARTINEZ BUENO, A. GALVEZ and M. MAQUEDA (2004): Effect of combined physico-chemical preservatives on enterocin AS-48 activity against the enterotoxigenic Staphylococcus aureus CECT 976 strain. J. Appl. Microbiol. 97, 48-56.
2. AYMERICH, T., M. GARRIGA, J. YLLA, J. VALLIER, J. M. MONFORT and M. HUGAS (2000): Application of enterocins as biopreservatives against Listeria innocua in meat products. J. Food Protect. 63, 721-726.
3. CALLEWAERT, R., M. HUGAS and L. DE VUYST (2000): Competitiveness and bacteriocin production of enterococci in production of Spanish style dry fermented sausages. Int. J. Food Microbiol. 57, 33-42.
4. CRK, D. and N. ZDOLEC (2018): Antimicrobial potential of enterococci isolated from raw milk. Hrv. vet. vjesnik 26, 30-34.
5. ENNAHAR, S. and N. DESCHAMPS (2000): Anti-Listeria effect of enterocin A, produced by cheese isolated Enterococcus faecium EFM01, relative to other bacteriocins from lactic acid bacteria. J. Appl. Microbiol. 88, 449-457.
6. GIRAFFA, G. (1995): Enterococcal bacteriocins their potencial as anti-Listeria factors in dairy technology. Food Microbiol. 12, 291-299.
7. JACK, R. W., J. R. TAGG and B. RAY (1995): Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59, 171-200.
8. KUBAŠOVÁ, I., V. STROMPFOVÁ and A. LAUKOVÁ (2017): Safety assessment of commensal enterococci from dogs. Folia Microbiol. 62, 491-498.
9. RUBIO, R., S. BOVER-CID, B. MARTIN, M. GARRIGA and T. AYMERICH (2013): Assessment of safe enterococci as bioprotective cultures in low-acid fermented sausages combined with high hydrostatic pressure. Food Microbiol. 33, 158-165.
10. SPARO, M., G. G. NUÑEEZ, G. G., M. GASTRO, M. L. CALCAGNO, M. A. GARCIA ALLENDE, M. CECI, R. NAJLE and M. MANGHI (2008): Characterictics of an environmental strain, Enterococcus faecalis CECT7121, and its effects as -additive on craft dry-fermented sausages. Food Microbiol. 25, 607-615.
11. VESKOVIĆ-MORAČANIN, S. (2010): Lactic acid bacteria bacteriocins as natural food protectors – possibilities of applications in food industry. Tehnolog ija mesa 51, 83-94.
12. VAN BELKUM, M. J. and M. E. STILES (2000): Nonlantibiotic antibacterial peptides from lactic acid bacteria. Nat. Prod. Rep. 17, 323-335.
13. ZDOLEC, N., M. HADŽIOSMANOVIĆ, L. KOZAČINSKI, Ž. CVRTILA, I. FILIPOVIĆ, M. ŠKRIVANKO and K. LESKOVAR (2008): Microbial and physicochemical succession in fermented sausages produced with bacteriocinogenic culture of Lactobacillus sakei and semi-purified bacteriocin mesenterocin Y. Meat Sci. 80, 480-487.
14. ZDOLEC, N., V. DOBRANIĆ, I. BUTKOVIĆ, A. KOTURIĆ, I. FILIPOVIĆ and V. MEDVID (2016): Antimicrobial susceptibility of milk bacteria from healthy and drug treated cow udder. Vet. arhiv 86, 163-172.
15. ZDOLEC, N., M. ČOP i V. DOBRANIĆ (2017): Primjena Enterococcus faecalis 101 iz mlijeka u proizvodnji trajnih kobasica. Hrv. vet. vjesnik 25, 56-62.
16. ZDOLEC, N. (2018): Technological interventions in fermented meat production: the commercial perspective. In: Panda, S. K., P. H. Shetty: Innovations in technologies for fermented food and beverage industries, Food Microbiology and Food Safety. Springer International Publishing AG, Cham (175-188).

▲

The effect of enterococcal bacteriocins on selected foodborne pathogens

Nina VUKUŠIĆ, DVM, Zagreb, Croatia; Nevijo ZDOLEC, DVM, PhD, Associate Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia

Enterococci have an important role in food fermentation and often exhibit probiotic properties. In this paper, their antimicrobial eff ect was investigated in vitro against the following reference strains and strains isolated from food: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica and Salmonella Typhimurium.
The agar diffusion method was used, and the supernatants were neutralized and treated with protease. Enterococcus faecalis EF-101 showed strong inhibitory activity against all strains of Listeria as well as the Y. enterocolitica O:3 strain. The activity of the proteinaceous inhibitor was 1280 AU/mL. Further research should be carried out to assess the potential use of enterocin as a natural preservation agent in food protection.
Key words: enterocin; bacterial pathogens; food of animal origin