Marica Lolić¹, Mario Škrivanko¹, Marija Krajina¹, Davor Balić¹, Dragan Brnić², Kristina Matković³
¹Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Vinkovci, Vinkovci, Hrvatska; Hrvatski veterinarski institut, ²Laboratorij za serološku dijagnostiku virusnih bolesti, Zagreb, Hrvatska; ³Zavod za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska
Izvor: Zbornik radova Veterinarski dani, Osijek, 2023.
SažetakUvodUzorkovanje materijala za patoanatomsku i histološku pretraguUzorkovanje uzoraka za bakteriološku i mikološku pretraguUzorkovanje uzoraka za virusološku i serološku pretraguUzorkovanje uzoraka za parazitološku pretraguUzorkovanje uzoraka za kemijsko-toksikološku pretraguPakiranje i slanje uzoraka u laboratorijZaključnoLiteraturaAbstract
Sažetak
L aboratorijska istraživanja bolesnih životinja značajno ovise o kvaliteti i prikladnosti uzoraka prikupljenih za analizu. Veterinari su stručnjaci koji su osposobljeni za obavljanje veterinarske profesije iz područja biomedicinske znanosti i smatraju se odgovornima za postavljanje konačne dijagnoze i odluke u vezi s rješavanjem zdravstvenih problema životinja u praksi. Veterinarski dijagnostički laboratorij važna je potpora veterinarskoj praksi u pružanju konzultantskih usluga, tehničke pomoći u izvođenju laboratorijskih ispitivanja, prikupljanju i širenju informacija o aktualnim istraživanjima. Točnost laboratorijskih rezultata i njihova učinkovitost u rješavanju zdravstvenih problema uvelike ovise o kliničkoj procjeni slučaja od strane veterinara, kao i o odabiru, obradi, pakiranju, čuvanju i prijevozu uzoraka koji se podnose na analizu. Uzorci se mogu uzimati od pojedinačnih životinja, iz populacije životinja ili iz okoliša za različite svrhe, kao što su dijagnoza bolesti, nadzor bolesti, potvrda o zdravstvenoj ispravnosti i praćenje odgovora na liječenje ili cijepljenje. Preporuke koje se odnose na ovu temu općenito i one koje se odnose na dijagnozu određenih pojedinačnih ili skupnih problema bolesti životinja predmet su ovog rada.
Ključne riječi: veterinar, laboratorijski stručnjak, uzorci, uzorkovanje i pakiranje uzoraka, bolesti životinja
Uvod
Svaki veterinarski dijagnostički laboratorij nudi jedinstveni skup dijagnostičkih testova koji su podložni određenim promjenama, zbog dostupnosti boljih testova na tržištu. Veterinari i stručnjaci dijagnostičkih laboratorija moraju održavati dobru komunikaciju kako bi što učinkovitije dovršili svoje dijagnostičke napore i pružili optimalnu uslugu klijentu. Veterinari moraju biti konkretni i jasni u svojim zahtjevima za ispitivanje, a laboratorijski stručnjaci mogu pružiti smjernice u vezi s prikupljanjem i rukovanjem uzoraka, kao i ponuditi pomoć u tumačenju rezultata ispitivanja (Bildfell, 2022.).
Uzorkovanje materijala za patoanatomsku i histološku pretragu
Histološka pretraga dopunska je mikroskopska dijagnostička pretraga kojom se utvrđuju patomorfološke promijene tkiva. Tkiva za histološku pretragu uzimaju se s živih životinja (poslije kirurških zahvata), uginulih (razudbe), te prinudno ili redovno zaklanih životinja. Uzeti uzorci trebaju biti veličine kocke šećera, debljine 1 cm (poželjno 5-7 mm), a rezovi moraju biti ravni, te usporedni i okomiti na površinu. Izresci se uzimaju s onih mjesta koja graniče s nepromijenjenim tkivom. Ekscizijske biopsije malih tumora (< 1,5 cm) mogu se prepoloviti. Veći tumori mogu se rezati poput kruha, tako da sredstvo za fiksaciju može prodrijeti do prednje strane svake kriške. Izrezana tkiva moraju se odmah staviti u ≥10 puta veći volumen sredstva za fiksaciju u staklenu ili plastičnu bočicu s dovoljno širokim grlom. Za fiksaciju tkiva upotrebljava se 10 % otopina formalina. Alkohol kao sredstvo za fiksaciju upotrebljava se samo u nuždi i to u 90% -tnoj % ili 96%-tnoj koncentraciji. Prije fiksacije tkivo se ne smije zamrzavati. Pojedina specifična tkiva zahtijevaju dodatnu pozornost. Sluznica probavnog trakta brzo se razgrađuje, pa je potrebno kratke dijelove crijeva otvoriti po dužini kako bi se omogućila odgovarajuća fiksacija preparata. Ako se uzima leđna moždina, duru mater također treba pažljivo zarezati po dužini. Za kompletnu analizu mozga potrebno je poslati cijeli, netaknuti, fiksirani mozak u velikom volumenu 10 % formalina unutar 24 sata. Ako se uzorak može poslati dostavom preko noći, bolje ga je poslati ohlađenog, pažljivo zapakiranog, bez fiksacije direktno u laboratorij. Mozak se može prepoloviti uzdužno, te se jedna polovica svježa, ohlađena, šalje na mikrobiološko pretragu, a druga polovica fiksira na histološku pretragu. Ovakav postupak može dati nezadovoljavajuće rezultate, ako se na mozgu nalazi jednostrana lezija (Bildfell, 2022.). Histološki uzorci trebaju se slati u nepropusnim spremnicima i pakirati na način koji sprječava prolijevanje ili smrzavanje tijekom prijevoza. ▲
Uzorkovanje uzoraka za bakteriološku i mikološku pretragu
Uzorci se uvijek uzimaju s rubnih dijelova promijenjenog tkiva, gdje su najbrojniji mikroorganizmi, čime se povećava uspješnost njihova izdvajanja u laboratoriju. Od bolesne životinje mogu se uzeti: krv, izmet, mokraća, sekret mliječne žlijezde, ispljuvak, cerebrospinalni likvor, obrisci kože, očnih spojnica, nosa, ždrijela, rodnice, grlića maternice, prepucija, rektuma, potom strugotine kože, dlake, punktati apscesa i edemske tekućine, obrisci fistula i bioptati (Habrun, 2014.).
Uzorci okoliša životinja pretražuju se kako bi se u njima ustanovila prisutnost patogenih mikroorganizma koji bi u određenim uvjetima mogli biti preneseni na ili u primljive životinje i u njima uzrokovati infekciju. Od uzoraka okoliša pretražuju se različiti životinjski nametnici, insekti, mali glodavci kao i stočna hrana, voda za napajanje, otpadna voda, stelja, uzorci tla ili obrisci nastambi i predmeta za njegu životinja.
Osnovni preduvjet za točnu dijagnozu jest svjež uzorak. Ako se uzimaju organi ili dijelovi organa od uginulih životinja uzorke treba uzeti što prije nakon uginuća životinje.
Uzimaju se svi promijenjeni dijelovi organa ili dostaviti čitave organe. Uzorci se uzimaju sterilno i aseptičkim priborom, kako se ne bi onečistili mikroorganizmima koji nisu uzrokovali bolest. Ako je uginuo veći broj životinja, treba uzeti i veći broj uzoraka radi pouzdane dijagnoze (barem 30% uginulih životinja). Svaki organ treba odvojeno zapakirati u sterilnu staklenu ili plastičnu posudu odnosno jednokratnu polivinilsku vrećicu. Obrisci kože i dostupnih sluznica uzimaju se pomoću sterilnih komercijalno dostupnih briseva. Ako se uzorak može dopremiti u laboratorij tijekom nekoliko sati, može se uporabiti obični bris. Ako će transport trajati dulje, obvezno se mora koristiti bris s transportnom podlogom iz razloga što su pojedine bakterije osjetljive na isušivanje, posebice pripadnici rodova Haemophilus, Pasteurella i Corynebacterium. Transportne podloge nemaju hranjivu vrijednost i ne omogućavaju razmnožavanje uzročnika, ali osiguravaju preživljavanje mikroorganizma do njihova nacjepljivanja u laboratoriju. Neke anaerobne bakterije ne mogu preživjeti dulje od 20 minuta ako su izložene atmosferskom kisiku. Vrlo je važno da se prilikom uzorkovanja uzorak ne onečisti dodirivanjem sluznice životinja, gdje ima saprofitskih aerobnih bakterija.
Kod uginuća životinja uzorci se moraju uzeti do četiri sata od uginuća, jer nakon toga parenhimne organe prerastaju anaerobne bakterije iz crijeva (bakterija Clostridium perfingens).
Kod sumnje na bedrenicu treba izbjegavati razudbu, jer uzročnik Bacillus anthracis u kontaktu sa zrakom tvori endospore (Habrun, 2014.). U laboratorij se šalje uška s dovoljno okolnog mišića, dobro zapakirana u nekoliko PVC vrećica. Može se uzeti krv iz repne vene ili površinskih ušnih vena.
Kod sumnje na bakterijemiju uzima se krv za hemokulturu, prema načelima asepse. Krv treba izvaditi u epruvetu s podlogom za hemokulturu (komercijalno dostupno).
Tekuće uzorke (sadržaj apscesa, crijeva, urin, sekret vimena krava) također treba slati u sterilnim posudama u količini do 10 ml.
Uzorke uzete za bakteriološku pretragu, ako su topli treba što prije ohladiti na temperaturu +4 do +8 ˚C, ohlađene staviti u plastični transportni hladnjak s dodatnim brojem uložaka za hlađenje i što prije dostaviti do laboratorija (Habrun, 2014.).
Uzorkovanje uzoraka za virusološku i serološku pretragu
Za virusološku pretragu uzimaju se uzorci po istom principu kao i za bakteriološku pretragu.
Od uginulih životinja uzimaju se organi ili dijelovi organa s najizraženijim patoanatomskim promjenama, odnosno oni organi koji sadrže najviše virusnog uzročnika, što je ovisno o pojedinoj virusnoj bolest. Kod septikemijskih bolesti uvijek se uzima: jetra, bubreg, slezena i limfni čvorovi. Krv se nakon vađenja prenosi u epruvetu s antikoagulansom kao što je etilen diamin tetraoctena kiselina (EDTA) ili heparin, do oznake na epruveti, nakon što je igla skinuta s brizgalice. Danas su u širokoj upotrebi epruvete s podtlakom. Prednost su zatvoren sustav, podtlak u epruveti točno određuje volumen izvađene krvi i osigurava određeni omjer krvi i antikoagulansa.
Odmah nakon vađenja krvi epruvetu treba vrlo lagano promiješati u ruci, držeći čep i dno epruvete (palcem i malim prstom) 4 do 5 puta kako bi antikoagulans inhibirao čimbenike nužne za proces koagulacije (Herak-Perković i sur., 2012.). Za lančane reakcije polimeraze (PCR) EDTA je preferirani antikoagulant. Zbog svojstva nestabilnosti pojedinih virusa, čije je vrijeme u vanjskom okolišu ograničeno, uzorke je potrebno konzervirati kako bi se sačuvala njihova aktivnost. To se postiže smrzavanjem na temperaturi -20 ˚C ili deponiranjem u 50 % glicerol ili puferiranom glicerinu.
Za dijagnostiku mnogih zaraznih, bakterijskih i parazitarnih bolesti, posebice za otkrivanje latentnih ili kroničnih bolesti najpouzdanija je serološka dijagnostika. Osnovni materijal za pretragu je serum. Da bi se serološkim pretragama postavila brza i pouzdana dijagnoza ili provjerila imunost potrebno je na pravilan način uzeti uzorak krvi i dostaviti ga u dijagnostički laboratorij.
Kod pojedinih akutnih zarazni bolesti (npr. leptospiroza) na pretragu treba poslati dva uzorka krvi (parni serumi) da bi se po visini titra protutijela mogla razlučiti sadašnja od prijašnje infekcije. Prvi uzorak uzima se u početku bolesti, a drugi u razmaku 10 do 14 dana. Na sadašnju infekciju upućuje znatno viši titar protutijela u drugom uzorku. Ako se u oba uzorka ustanovi podjednaki titar protutitijela, riječ je o protutijelima koja su preostala od prijašnje infekcije. Krv se uzima sterilnom iglom i stavlja u sterilnu epruvetu, ako je moguće u količini od najmanje 10 ml. Da bi se izbjeglo stvaranje pjene, mlaz krvi treba usmjeriti tako da krv klizi uz stjenku epruvete. Ako epruveta sadrži premalo krvi u epruveti, tijekom prijevoza zbog mućkanja može doći će do razbijanja eritrocita i hemoliziranja serum koji nije prikladan za pretragu. Da bi se dobio kvalitetan uzorak seruma, važno je da se krv nakon vađenja ostavi na sobnoj temperaturi da se dobro zgruša. Nakon zgrušnjavanja pohrani se u hladnjak na + 4 ˚C i drži do slanja u laboratorij.
Uzorkovanje uzoraka za parazitološku pretragu
Najčešći uzorci koji se dostavljaju na pretragu su: izmet, krv, urin, ispirak dušnika, mišićno tkivo, strugotina kože, cijeli endo- i ektoparaziti, uzorci tkiva ili organa, hrana i uzorci iz okoliša kao što su tlo i kompostirani materijali. Od uginulih životinja na pretragu se može uzeti cijeli probavni trakt ili dijelovi tkiva s parazitima, krv, ciste, sadržaj crijeva i pronađeni paraziti. Uzorci izmeta trebaju biti svježi, po mogućnosti uzeti od životinje tijekom defekacije ili iz rektuma tijekom pregleda. Krv se uzima u običnu i epruvete s antikoagulansom.
Strugotina kože za dijagnozu šugaraca uzima se struganjem lezije skalpelom skroz dok se ne dođe do krvi i stavlja u plastičnu epruvetu. Ektoparazite i nematode koji se dostavljaju na identifikaciju trebaju se dostaviti u 70 % alkoholu.
Uzorkovanje uzoraka za kemijsko-toksikološku pretragu
Od žive životinje treba poslati krv (najmanje 10 ml pune krvi), mokraću (50 ili više ml), izmet i povraćani sadržaj želuca, te 500 ml mlijeka.
Kada se radi o lešini, mala životinja šalje se cijela, a od velikih treba odmah nakon uginuća uzeti i poslati 5 ml krvnog seruma ili 10 ml pune krvi (uzete iz srca), te 250 do 300 g tkiva bubrega, jetre, slezene, mozga, pluća, masnog tkiva, kostiju, kože, ovisno o vrsti sumnjiva otrova, te do 2 kg sadržaja želuca i crijeva odnosno predželudaca (ili cijeli podvezani želudac, tanko i debelo crijevo).
Pri sumnji na kronično trovanje arsenom ili živom treba poslati i nekoliko grama dlake. Uz gore navedene uzorke, ako postoji, treba poslati i sumnjivu tvar kojom se životinja otrovala (pesticid, umjetno gnojivo), sumnjivu hranu (sijeno 3 do 5 kg, zrna ili smjese 1 kg) i vodu (Srebočan, 1993.). Uz uzorke treba dostaviti podatke o vrsti, dobi i spolu životinje, anamnezi, kliničkoj slici otrovanja, razudbeni nalaz, o vrsti i količini primljeni lijekova, te navesti naziv otrova ili skupine otrova na koje se sumnja da su uzrok otrovanja. Korisno je dati i podatke o području boravka životinje, podatke o upotrebi pesticida, posebno rodenticida i insekticida i podatke o blizini odlagališta otpada. Uzorak koji se uzima za pretragu treba maksimalno zaštititi od zagađenja od okoliša i ne smije se ništa ispirati, jer se tako mogu otkloniti i ostaci otrova. Uzorke tkiva treba zamrznuti i spakirati tako da u laboratorij stignu smrznuti (Srebočan, 1993.). Uzorke pojedinih organa treba slati odvojeno u označenim čistim plastičnim vrećicama.
Za kemijsku analizu ne smiju se dodavati konzervansi.
Krv je bolje ne smrzavati, ali je treba upakirati tako da bude hladna. Krv se uzima u epruvete s antikoagulansima, ali izbor ovisi o kemijskoj strukturi toksične sumnjive tvari. Heparin je prikladniji za ispitivanje anorganskih kationa i aniona, dok Na-citrat ili EDTA manje smetaju pri dokazivanju sumnjiva organskog spoja. Serum treba odvojiti od ugruška u roku od dva sata nakon uzimanja, a može se i zamrznuti. Tekući uzorci šalju se u plastičnim ili staklenim posudama koje se mogu dobro zatvoriti.
Uzorak vode treba dostaviti što prije do laboratorija zbog kemijskih i bioloških promjena u uzorku vode koje se zbivaju brže nego u prvobitnoj sredini. Stoga na uzorak vode treba naznačiti datum i vrijeme uzimanja uzorka (Srebočan, 1993.).
Pakiranje i slanje uzoraka u laboratorij
Prilikom označavanja vrećica i spremnika za uzorke potrebno je koristiti vodootporne markere: sadržaj i identifikacija uzorka ključne su informacije.
Sekundarni spremnik se zatim stavlja u kutiju za otpremu (tercijarni spremnik), u kojoj se često nalaze paketi rashladne tekućine kao i različiti materijali za amortizaciju (npr. polistirenska pjena) za zaštitu uzorka. Materijali rashladnog sredstva trebaju biti zatvoreni u plastičnim vrećicama kako bi se spriječilo oštećenje kondenzacijom. Pakete rashladne tekućine ne treba stavljati izravno na uzorke, kao što su epruvete pune krvi, koji bi mogli pretrpjeti štetne učinke ako se zamrznu tijekom prijevoza. Tercijarni spremnik idealno je čvrsta polistirenska kutija za hlađenje ili kartonska kutija obložena postavljenom polistirenskom oblogom. Ako se koristi suhi led, to treba biti naznačeno na naljepnici kartonske kutije, a poklopac se ne smije lijepiti trakom. Inače, ugljikov dioksid oslobođen od suhog leda mogao bi povećati pritisak i oštetiti paket ili sadržaj (Bildfell, 2022.).
Zapakirani uzorci u pošiljci moraju biti obilježeni tako da se broj, naziv organa ili drugi podatak napiše flomasterom na posudu ili vrećicu (ili se stavlja naljepnica s podacima). Podaci na uzorku moraju odgovarati onom iz popratnog dopisa ili uputnice.
Poprati dopis mora biti zapakiran u vodonepropusnu vrećicu kako bi se zaštitio od bilo kakvih tekućina koje bi mogle biti prisutne u pakiranoj pošiljci.
Popratni dopis treba sadržavati: ime i adresu pošiljatelja, ime i adresu vlasnika, datum uzorkovanja, vrstu životinje, spol, dob, identifikaciju životinje, kliničke znakove, grubi izgled (veličinu i mjesto) lezije, razudbeni nalaz (ako je rađen), prethodno liječenje, morbiditet, mortalitet u skupini i vrstu pretrage. Ako se sumnja na zoonozu, također treba biti jasno naznačeno na obrascu za podnošenje kako bi se upozorilo laboratorijsko osoblje. Uzorci do dijagnostičkog laboratorija mogu se dostaviti osobno vozilom ili brzom poštom.
Zaključno
Literatura [… prikaži]
SAMPLING, PACKAGING AND SENDING SAMPLES OF ANIMAL ORIGIN AND THEIR ENVIRONMENT TO THE LABORATORY
Marica Lolić¹, Mario Škrivanko¹, Marija Krajina¹, Davor Balić¹, Dragan Brnić², Kristina Matković³
L aboratory analysis of sick animals depend critically on the quality and suitability of collected samples. Veterinarians are specialists who are trained to perform the veterinary profession in the field of biomedical science and are considered responsible for making the final diagnosis and decisions regarding the treatment of animal health problems in practice. A veterinary diagnostic laboratory is an important support for veterinary practice providing consulting services, technical assistance in performing laboratory tests, collecting and disseminating information on current research. The accuracy of laboratory results and their effectiveness in solving health problems depend greatly on the clinical assessment of the case by the veterinarian, as well as on the selection, processing, packaging, storage and transportation of the samples submitted for analysis. Samples may be taken from individual animals, from animal populations or from the environment for a variety of purposes, such as disease diagnosis, disease surveillance, health certification, and monitoring response to treatment or vaccination. Recommendations related to this topic in general and those related to the diagnosis of certain individual or collective animal disease problems are the subject of this paper.
Key words: veterinarian, laboratory specialist, samples, sampling and packaging of samples, animal diseases
Vezano (uzorkovanje):
- Osnovna načela određivanja veličine uzoraka u veterinarskim istraživanjima
- Naknade za propisane veterinarske usluge za 2022. godinu
- Objavljen Plan uzorkovanja hrane životinjskog podrijetla u 2022. godini
- Uzorkovanje hrane, vode za ljudsku potrošnju te obrisaka površina na mikrobiološku ispravnost
- Tehnička nadogradnja dijela aplikacije HPA