Jerka Mesarić, Ivana Kiš, Lea Aračić, Dora Ivšić-Škoda, Jadranka Foršek, Vesna Matijatko, M. Torti, Mirna Brkljačić i V. Mrljak
Jerka MESARIĆ, dr. med. vet.; dr. sc. Ivana KIŠ, dr. med. vet., docentica, Dora IVŠIĆ ŠKODA, dipl. ing., Jadranka FORŠEK, dipl. ing., dr. sc. Vesna MATIJATKO, dr. med. vet., izvanredna profesorica, Marin TORTI, dr. med. vet., znanstveni novak-asistent, dr. sc. Mirna BRKLJAČIĆ, dr. med. vet., viša asistentica, dr. sc. Vladimir MRLJAK, dr. med. vet., redoviti profesor, Veterinarski fakultet Zagreb; Lea ARAČIĆ, dipl. ing.
Uvod
U biokemijskom laboratoriju Klinike za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta u Zagrebu od svibnja 2009. godine provodi se određivanje koncentracije žučnih kiselina u uzorcima seruma. Uvođenje ovog dijagnostičkog postupka predstavlja novost u veterinarskoj praksi u Hrvatskoj, a povećava naše dijagnostičke mogućnosti u područjima gastroenterologije i neurologije. Budući da nam je ova dijagnostička metoda u svakodnevnoj praksi postala lako dostupna želimo obnoviti naše znanje o žučnim kiselinama, od fiziologije i laboratorijskih dijagnostičkih postupaka pa sve do diferencijalne dijagnostike i terapije. Cilj je ovog rada da pravilnom uporabom ovog dijagnostičkog „alata“ za naše pacijente postignemo najveću moguću dijagnostičku sigurnost.
Nastajanje i uloga žučnih kiselina u organizmu
Primarne se žučne kiseline, kolna i henodeoksikolna, sintetiziraju u jetri iz kolesterola (Radominska i sur., 1993.).
U tom procesu postoji više koraka, no najznačajniji je 7α-hidroksilacija koja je ujedno i ograničavajući korak u proizvodnji žučnih kiselina (Karlson, 1988.). U hepatocitima se nadalje odvija konjugacija žučnih kiselina s taurinom i glicinom, a samo je rijetko moguća konjugacija sa sulfatom ili glukonatom (Stockham i Scott, 2008.). U pasa se konjugacija odvija gotovo isključivo s taurinom, a u mačaka većinom s taurinom. Tek kad su konjugirane u hepatocitima, žučne se kiseline izlučuju u žuč (Anwer i Meyer, 1995.).
Moguće je da vrlo mala količina nekonjugiranih žučnih kiselina „pobjegne“ u žuč, no te će nekonjugirane žučne kiseline biti reapsorbirane od strane epitelnih stanica žučovoda i vraćene u hepatocite na konjugiranje prije ponovnog izlučivanja. Konjugiranje je žučnih kiselina vrlo učinkovit proces tako da je, primjerice, u ljudi u žučnoj vrećici prisutno manje od 1% nekonjugiranih žučnih kiselina (Guyton i Hall, 2006.).
Konjugacija žučnih kiselina povećava njihovu otpornost precipitiranju s dvovalentnim kationima poput iona kalcija (Ca++). Nadalje, konjugiranje povećava ioniziranost žučnih kiselina te time topljivost u kiseloj sredini, a ioniziranost čini da žučne kiseline postanu prejakog naboja da bi bile reapsorbirane kroz stanice crijeva takozvanom transcelularnom apsorpcijom. Budući da konjugacija povećava i veličinu molekule, žučne kiseline postaju prevelike da bi bile reapsorbirane takozvanom paracelularnom apsorpcijom kroz specifične veze među enterocitima tzv. čvrste spojeve (engl. tight junctions).
Smisao je konjugacije da žučne kiseline u lumenu crijeva ostanu djelovati na njegov sadržaj sve dok ne dospiju u ileum gdje bivaju reapsorbirane zahvaljujući prisutnosti specijalnog receptora koji posreduje u njihovoj reapsorpciji (Guyton i Hall, 2006.).
Za strukturu molekula žučnih kiselina karakteristično je da im je hidrofilni dio s hidroksilnim skupinama i peptidnom vezom na jednom kraju molekule, a da im je na drugom kraju molekule hidrofobni steroidni dio što im omogućava da tvore jednostavne i složene micele te da na taj način djeluju kao biološki deterdženti (Karlson, 1988., Anwer i Meyer, 1995.).
Djelovanjem kolecistokinina, koji se oslobađa posljedično unošenjem hrane, dolazi do kontrakcije žučnog mjehura te žuč sa žučnim kiselinama dospijeva u duodenum. Uvijek treba imati na umu da do kontrakcije žučnog mjehura može doći i bez stimuliranja unošenjem hrane (Stockham i Scott, 2008.).
U tankom crijevu izlučene žučne kiseline ostvaruju svoju ulogu i zajedno s enzimima gušterače sudjeluju u razgradnji lipida. Žučne kiseline, zahvaljujući svojoj, već spomenutoj, molekularnoj građi, dispergiraju masti unesene hranom tvoreći micele.
Micele su male cilindrične kugle veličine 3-6 nm koje se sastoje od površinskog dijela kojeg čini 20-40 molekula žučnih kiselina poredanih tako da im je hidrofilni dio usmjeren prema van, a hidrofobni dio prema unutrašnjosti u kojoj se mogu nalaziti neprobavljene masti, monogliceridi i slobodne masne kiseline ili kolesterol. Bez prisutnosti žučnih kiselina u fecesu bi se izgubilo oko 40% unesenih masti (Guyton i Hall, 2006.). Naravno, zajedno s masnim kiselinama dispergiraju se vitamini i lijekovi topljivi u mastima. Stoga možemo zaključiti da žučne kiseline imaju odlučnu ulogu u razgradnji i apsorpciji masti te da njihov nedostatak može prouzročiti malapsorpciju masti i znatan nedostatak vitamina topivih u mastima.
U lumenu crijeva, međutim, pod djelovanjem bakterijske flore može doći do strukturnih modifikacija žučnih kiselina u smislu dekonjugacije i dehidroksilacije.
Djelovanjem bakterijskih dekonjugaza nastaju ponovno nekonjugirane žučne kiseline koje difundiraju kroz crijevnu sluznicu u portalnu krv te bivaju rekonjugirane u hepatocitima i ponovno izlučene sa žuči. Dehidroksilacijom nastaju sekundarne žučne kiseline: deoksikolna nastaje iz kolne kiseline, a litokolna iz henodeoksikolne kiseline.
Ursodeoksikolna kiselina isto tako nastaje iz henodeoksikolne kiseline zajedničkim utjecajem bakterija i jetre. Sekundarne žučne kiseline se reapsorbiraju istim mehanizmom kao i primarne i doprinose normalnom sastavu žuči. U sastavu žuči zdravih pasa prevladava kolna kiselina, a u zdravih mačaka deoksikolna kiselina.
Žučne se kiseline reapsorbiraju u portalnu krv s učinkovitošću od 90-95% (Anwer i Meyer, 1995.), oko polovice se resorbira putem difuzije u tankim crijevima, a druga polovica u distalnom ileumu aktivnim transportom kako je već navedeno. Izgubljeni se dio žučnih kiselina nadoknađuje sintezom u jetri.
Prosječno jedna molekula žučne kiseline 17 puta prođe enterohepatičku cirkulaciju prije nego bude izlučena s fecesom (Guyton i Hall, 2006.).
Zanimljivo je da se sekundarne žučne kiseline reapsorbiraju prema svojoj topljivosti u vodi pa će biti reapsorbirano relativno mnogo deoksikolne kiseline, a samo vrlo malo litokolne kiseline.
Smatra se da je uzrok slabije reapsorpcije litokolne kiseline činjenica da je ona često konjugirana sa sulfatom i ima samo jednu hidroksilnu skupinu. Zahvaljujući slaboj reapsorpciji koncentracija litokolne kiseline u serumu je niska, ali je razmjerno visoka u fecesu. Za deoksikolnu kiselinu vrijedi obrnuto pravilo: njezina će koncentracija u serumu biti relativno visoka, a u fecesu relativno niska.
Zdrava jetra, bez portovaskularnih anomalija (PVA), učinkovito uklanja reapsorbirane žučne kiseline iz portalne cirkulacije zahvaljujući prisutnosti transportera na sinusoidalnoj membrani hepatocita. Ekstrakcijska učinkovitost je u prvom prolazu 75%-90%, i to je razlog da je koncentracija žučnih kiselina u sistemskoj cirkulaciji u zdravih životinja znatno niža nego u portalnoj cirkulaciji (Anwer, 1993.), ali pojačana postprandijalna reapsorpcija žučnih kiselina iz crijeva rezultira i fiziološkim povećanjem koncentracije žučnih kiselina u postprandijalnom uzorku (Stockham i Scott, 2008.) budući da, kao što je navedeno, niti potpuno zdrava jetra pri prvom prolazu ne može ekstrahirati sve žučne kiseline. Određivanje koncentracije žučnih kiselina rabi se za dijagnosticiranje bolesti jetrenog parenhima (Cullen, 2009.), žučovoda (Center, 2009.) i urođenih ili stečenih vaskularnih anomalija (Allen i sur., 1999., Gerritzen-Bruning i sur., 2006., Ruland i sur., 2010.).
Reapsorbirane molekule žučnih kiselina koje su izbjegle enterohepatičku cirkulaciju i završile u sistemskoj cirkulaciji uklanjaju se glomerularnom filtracijom i izlučuju u urinu (Stockham i Scott, 2008.), a značenje njihove prisutnosti u urinu se još istražuje (Balkman i sur., 2003., Trainor i sur., 2003.).
Dijagnostičke metode za utvrđivanje žučnih kiselina
Za određivanje ukupnih i/ili pojedinačnih žučnih kiselina u biološkim uzorcima možemo rabiti više različitih metoda. Na raspolaganju su nam različite kromatografske, enzimske i radioimunološke metode u većim specijaliziranim laboratorijima te na enzimima zasnovana analitička metoda tvrtke IDEXX koja se može provoditi i u priručnim laboratorijima malih ambulanti (Stockham i Scott, 2008.).
Najčešće se analiziraju uzorci seruma.
U kliničkim se laboratorijima u rutinskom radu za određivanje ukupnih žučnih kiselina najčešće rabe biokemijski analizatori, koji za izvođenje većine biokemijskih testova rabe enzimske metode, uključujući i određivanje ukupnih žučnih kiselina. Najpoznatije su enzimska kolorimetrijska i enzimska kinetička amplifikacijska metoda.
Enzimska se kolorimetrijska metoda (tzv. 3. generacija testova) za određivanje ukupnih žučnih kiselina većinom koristi u manjim laboratorijima. Reagensi 3. generacije za određivanje ukupnih žučnih kiselina su u liofiliziranoj formi praška, pa je prije uporabe potrebno primijeniti postupke za otapanje. Ova enzimatska kolorimetrijska metoda koristi enzim 3-α-hidrosteroid dehidrogenazu (3-a-HSD) koja katalizira reakciju oksidacije pretvarajući 3-α-hidroksil grupu svih žučnih kiselina u 3-keto grupu uz prisustvo NAD+koenzima.
Nastali koenzim NADH dalje reagira s nitrotetrazolium blue (NBT) uz prisustvo enzima diaforaze pri čemu nastaje boja formazan. Boja formazan je stabilna plava boja čija se apsorbancija mjeri kod 546 nm. Intenzitet je nastale boje direktno proporcionalan koncentraciji žučnih kiselina u uzorku seruma. Preporučljivo je da svaki laboratorij uspostavi vlastite referentne raspone s obzirom na dob, spol, prehranu i geografski smještaj. Metoda je linearna do koncentracija od 150 μmol/L.
Uzorci bi iznad ove koncentracije trebali biti razrijeđeni s 0,9% otopinom NaCl.
Ova se dijagnostička metoda rabi u biokemijskom laboratoriju Klinike za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta u Zagrebu.
Enzimska je kinetička amplifikacijska metoda (tzv. 5. generacija testova) trenutno u kliničkim laboratorijima najviše rasprostranjena metoda za određivanje ukupnih žučnih kiselina. To je stabilna metoda s reagensima u tekućem obliku spremnim za direktnu uporabu na svim tipovima automatiziranih biokemijskih analizatora. Brzina stvaranja NADH koenzima se detektira kod 405 nm i proporcionalna je količini ukupnih žučnih kiselina u uzorku. Enzimska kinetička amplifikacijska metoda ima mnogo veće analitičke mogućnosti nego konvencionalne metode za određivanje žučnih kiselina (Griffiths i Sjövallb, 2010.).
Kromatografske su metode u rutini veoma rijetko metode izbora te ih treba primjenjivati u slučajevima kada je potpuno jasna njihova prednost pred ostalim metodama za rješenje specifičnog problema (Griffiths i Sjövallb, 2010.). Najčešće se rabe plinsko-tekućinska kromatografija i plinsko-tekućinska kromatografija – masena spektrofotometrija, a i tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti te plinska kromatografija-masena spektrofotometrija. Ako nije udružena s masenom spektrometrijom, specifičnost plinsko-tekućinske kromatografije je samo djelomična, analogna manjoj specifičnosti visokotlačne tekućinske kromatografije bez masene spektrometrije. Ovom se metodom najbolje analiziraju kompletne mješavine nekonjugiranih žučnih kiselina (Wang i Griffiths, 2007.). Plinska kromatografija u kombinaciji s masenom spektrofotometrijom bila je upotrebljavana godinama te je metoda izbora za opsežnije analize. Unatoč napretku u plinsko-kromatografskim analizama za mjerenje slobodnih žučnih kiselina, ovom se metodom ne mogu odvojiti pojedinačne konjugirane žučne kiseline. Stoga se metodom plinske kromatografije masene spektrofotometrije najbolje analiziraju kompletne mješavine nekonjugiranih žučnih kiselina (Wang i Griffiths, 2007.).
Nadalje, priprema je uzoraka za ovu metodu složena te uključuje poteškoće i u preciznosti i točnosti.
U novije vrijeme u kliničkoj medicini tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) daje podatke i o konjugiranim i o slobodnim žučnim kiselinama (Cantafora i sur., 1987.).
Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti uključuje određivanje koncentracije različitih tauro- i glicin- konjugata u složenim mješavinama žučnih kiselina u tekućim medijima. Metode za odvajanje takvih mješavina iziskuju dugotrajnu pripremu uzorka. Iako ove metode daju točne rezultate, pripremni procesi ekstrakcije i evaporacije su dugotrajni, zahtijevaju dodatnu stručnost osoblja i nepraktični su za eksperimente s većim brojem uzoraka. HPLC u kombinaciji s masenom spektrofotometrijom se pokazala kao jedna od pouzdanijih metoda za određivanje kemijskih spojeva u biološkim uzorcima (Jones i Chen, 2003.).
Kromatografske analitičke metode se najčešće rabe u visokoopremljenim istraživačkim laboratorijima te u situacijama kada želimo žučne kiseline mjeriti i u drugim biološkim materijalima kao što su urin i feces. No, za rad na takvoj opremi, kao što je već spomenuto, osoblje mora biti educirano, a potrebno je i znatno više vremena da se provedu navedene analize.
Za male klinike tvrtka IDEXX proizvela je tzv. „IDEXX SNAP bile acids“ test za kvantitativno određivanje žučnih kiselina, za koji je isto tako potreban čitač istog proizvođača koji se može rabiti i za druge IDEXX SNAP testove (Holbrook i sur., 2005.).
Preanalitički postupci kod enzimatskih metoda za određivanje žučnih kiselina
Da bi se dobili vjerodostojni rezultati izvođenjem testova za određivanje žučnih kiselina potrebno je znati da na rezultate testa može utjecati lipemija, a i hemoliza, i to značajno. Dokazano je da koncentracija hemoglobina do 50 mg/dL ne interferira s enzimatskim metodama, a kad se koristi enzimska kinetička metoda, lipemija i hemoliza imaju manji učinak.
Sa stanovišta biokemijskog laboratorija za određivanje ukupnih žučnih kiselina kao uzorak se preferira serum. Ako je serum nedostupan, može se koristiti i heparizirana plazma, ali povrat ukupnih žučnih kiselina je samo 90% od ukupnih žučnih kiselina u serumu (Wang i Griffiths, 2007.).
Postupak određivanja koncentracije preprandijalnih i postprandijalnih žučnih kiselina
Iako ne postoji univerzalno dogovoreni standard prema kojemu bi se trebalo provoditi određivanje žučnih kiselina u serumu, na najvećem se broju veterinarskih klinika, a tako i na Klinici za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta u Zagrebu, provodi sljedeći postupak:
nakon dvanaestsatnog posta uzima se prvi uzorak krvi u epruvete za odvajanje seruma i nakon toga se životinji daje jesti.
Smatra se da je dovoljna količina hrane dvije žličice hrane mačkama i malim psima, a dvije žlice hrane srednjim i velikim psima. Uobičajeno je da se za test rabi normalna balansirana konzervirana hrana namijenjena psima i mačkama.
Dva sata nakon unošenja hrane uzima se drugi uzorak krvi, također u epruvetu za odvajanje seruma (Stockham i Scott,2008.).
Sažetak
Za određivanje ukupnih i/ili pojedinačnih žučnih kiselina u biološkim uzorcima na raspolaganju su nam različite kromatografske, enzimske i radioimunološke metode u većim specijaliziranim laboratorijima te na enzimima zasnovana analitička metoda tvrtke IDEXX.
Enzimska kolorimetrijska metoda, tzv. 3. generacija testova je metoda koja se rabi u laboratoriju Klinike za unutarnje bolesti Veterinarskog fakulteta u Zagrebu.
Literatura [… prikaži]
Bile acids in dogs and cats physiological and laboratory analytical methods for determination of the concentration of bile acids in biological samples
Jerka MESARIĆ, DVM; Ivana KIŠ, DVM, PhD, Assistant Professor, Dora IVŠIĆ ŠKODA, BSc, Jadranka FORŠEK, BSc, Vesna MATIJATKO, DVM, PhD, Associate Professor, Marin TORTI, DVM, Junior Researcher-Assistant, Mirna BRKLJAČIĆ, DVM, PhD, Senior Assistant, Vladimir MRLJAK, DVM, PhD, Full Professor, Faculty of Veterinary Medicine, Zagreb; Lea ARAČIĆ, BSc
To determine the total or single bile acids, different chromatographic, enzymatic and radioimmunology methods adapted for larger research laboratories can be used. For small clinics IDEXX has developed the enzyme-based assay IDEXX SNAP® Bile Acids, which is easy to use for veterinary clinicians. Enzyme-based colorimetric method is the third generation of tests in use at the laboratory of Clinic for Internal Diseases of the Faculty of Veterinary Medicine.